Körpereigene Produktion von Erythropoietin (EPO)
Endogenous Production of Erythropoietin (EPO)
ZUSAMMENFASSUNG
Erythropoietin (EPO) hemmt die Apoptose der Erythrozytenvorläufer im Knochenmark, und es beschleunigt deren Proliferation und Differenzierung. Dieser Artikel beschreibt die physiologisch-chemischen Mechanismen der Regelung der Erythropoiese durch EPO. Hauptproduzenten des Hormons sind Fibroblasten in der Nierenrinde. Der Transkriptionsfaktor GATA-2 bremst den EPO-Promotor unter normoxischen Bedingungen. Noch wichtiger sind die heterodimeren (∝/β), sog. Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren (HIF). HIF-∝ Proteine werden in Anwesenheit von O2 (Normoxie) eliminiert, während sie unter hypoxischen Bedingungen im Komplex mit HIF-1β den EPO-Enhancer antreiben. Für die normoxische Elimination sind spezifische HIF-∝ Hydroxylasen verantwortlich: Drei Prolyl-Hydroxylasen (PHD-1, -2 und -3) induzieren den proteasomalen Abbau von HIF-∝ und eine Asparaginyl-Hydroxylase senkt das Transaktivierungspotential. Die HIF-∝ Hydroxylasen enthalten Fe2+ und benutzen ∝-Ketoglutarat als Kofaktoren. Eisenchelatoren sowie ∝-Ketoglutarat-Kompetitoren (sog. „HIFStabilisatoren“) hemmen die HIF-∝ Hydroxylasen und steigern die HIF-abhängige EPO-Expression. Die HIF-Stabilisatoren sind strukturell einfach aufgebaut und oral wirksam. Die Hypoxie induzierte EPO-Expression ist dynamisch, d.h. die Produktion von EPO steigt bei O2-Mangel zunächst stark an und sinkt dann trotz fortgesetzter Hypoxie. Möglicherweise wird die EPO-Synthese in den Nieren durch O2-Sensoren im Gehirn beeinflusst. Körperliche Belastung (Sport) beeinflusst die EPO-Produktion nicht wesentlich. Die Rolle humoraler Botenstoffe ist insgesamt unbedeutend, am wirksamsten sind Schilddrüsenhormone (T3/T4). EPO und Angiotensin II kooperieren bei der Aufrechterhaltung des Blutvolumens. EPO Überproduktion führt zur Erythrozytose und EPO-Mangel zur Anämie (z.B. bei chronischen Nierenerkrankungen). Rekombinantes EPO ist ein wichtiges antianämisches Medikament, aber als Dopingmittel gesundheitsgefährdend.
Schlüsselwörter: Blutdoping, Erythrozyten, Genexpression, Hämoglobin, Hypoxie, rote Blutzellen, Sauerstofftransport
SUMMARY
Erythropoietin (EPO) maintains the mass of red blood cells by promoting the survival, proliferation and differentiation of erythrocytic progenitors in the bone marrow. The present article summarizes molecular and systemic mechanisms in EPO´s control of erythropoiesis. Circulating EPO originates mainly from fibroblasts in the renal cortex. EPO production is controlled at the transcriptional level. GATA-2 blocks the EPO-promoter in normoxia, but is removed in hypoxia. Even more important is the regulation by the heterodimeric (∝/β) hypoxia-inducible transcription factors (HIFs). HIF- subunits are inactivated in normoxia involving three HIF-∝ prolyl hydroxylases (PHD-1, -2 and -3), which initiate the proteasomal degradation of HIF-∝, and an asparaginyl hydroxylase, which prevents trans-activation. In hypoxia, the HIF-∝/β complexes stimulate the EPO enhancer. The HIF-∝ hydroxylases contain Fe2+, and they use ∝-ketoglutarate as co-factor. Small molecule inhibitors of the HIF-∝ hydroxylases ("HIF-stabilizers") have been described, which are effective orally. The in vivo EPO response on hypoxic stress is dynamic, i.e., the concentration of circulating EPO rises initially sharply and then declines despite persisting O2 deficiency. Physical work (sport) has no major direct influence on EPO production. Overall, humoral mediators play a minor role; most likely thyroid hormones (T3/T4) are stimulators. EPO and angiotensin II cooperate in the maintenance of the blood volume. EPO overproduction leads to erythrocytosis. EPO deficiency causes anemia, such as in chronic kidney disease. Here, recombinant EPO can be of use.
Key Words: Blood doping, Erythrocytes, Gene expression, Hemoglobin, Hypoxia, Red blood cells, Oxygen transport
EINLEITUNG
Der gesunde Mensch bildet pro Sekunde etwa 3 Mio. neue Erythrozyten. Diese sind Nachkommen der erythrozytären Vorläufer, die sich im roten Knochenmark vermehren. Zur Proliferation benötigen die Vorläuferzellen das Hormon Erythropoietin (EPO; altgriechisch erythros =rot und poiein=machen). Die Beziehung zwischen Erythropoieserate und O2-Gehalt des Blutes beschrieb 1890 erstmals der französische Anatom Francois Gilbert Viault (70). Viault hatte festgestellt, dass seine roten Blutzellen (RBZ) während einer Reise in das Hochland von Peru (Morococha, ~ 4500 m ü. M.) drastisch zunahmen. In der Tat stellt die Verringerung der O2-Versorgung des Gewebes den wichtigsten Reiz für die Expression des EPO-Gens (EPO) dar. Dieser Artikel beschreibt das heutige Verständnis der Regulation der Erythropoiese durch EPO, wobei physiologisch-chemische Schwerpunkte gesetzt werden.
STRUKTUR UND FUNKTION
Menschliches EPO ist ein 30 kDa Glykoprotein aus einer Peptidkette von 165 Aminosäuren und 4 Glykanen. Die Feinstruktur der Glykane der einzelnen EPO-Moleküle unterscheidet sich (66). Es besteht eine Mikroheterogenität, die sich nach isoelektrischer Fokussierung von Serum- oder Urinproben beim Immunblotting als Bandenmuster zeigt (41). EPO-Aktivitäten werden in der Regel in Internationalen Einheiten (IE) angegeben, wobei 1 IE die gleiche Erythropoiese stimulierende Aktivität wie 5µmol Cobaltchlorid aufweist (vgl. (31)).
EPO hemmt den programmierten Zelltod (Apoptose) der Erythrozytenvorläufer im Knochenmark (Abb. 1) und fördert deren Proliferation (39). Das Hormon bindet an spezifische Rezeptoren (EPO-R) (13). Der menschliche EPO-R ist ein transmembranäres 484 Aminosäure-Glykoprotein von etwa 60 kDa. Nach EPO-Bindung an ein EPO-R Homodimer werden intrazellulär Janus-Kinasen 2 ( JAK2) aktiv, welche die Phosphorylierung von Tyrosylresten des EPO-R und verschiedener intrazellulärer Proteine (Enzyme und Transkriptionsfaktoren) katalysieren (19). Die EPO-empfindlichsten Zellen sind die sog. “Colony-Forming Units-Erythroid“ (CFU-Es). Aus diesen wachsen in Anwesenheit von EPO innerhalb von ca. einer Woche Kolonien (8-64 Zellen) hämoglobinhaltiger Zellen heran (Abb. 1).
Die Erythropoiese verläuft langsam, denn sie umfasst viele Zellteilungen. Nach einem akuten Anstieg der EPO-Konzentration im Blut dauert es 3 bis 4 Tage, bis signifikant mehr junge rote Blutzellen (Retikulozyten) aus dem Knochenmark in das Blut gelangen (46). Verschiedene Hormone verstärken die EPO-Wirkung. Testosteron fördert die Proliferation der erythrozytären Vorläufer (8), daher die höheren Erythrozyten-, Hämatokrit (Hkt)- und Hämoglobin [Hb]-Werte im Blut von Männern gegenüber Frauen. Somatotropin (Wachstumshormon) und “Insulin-Like Growth Factor 1“ (IGF-1) steigern ebenfalls die Erythropoiese (28).
EPO IN DER BLUTZIRKULATION
Systemische EPO-Spiegel
Teleologisch betrachtet hat EPO die Funktion, die Hb-Konzentration des Blutes (bei Normovolämie) konstant zu halten und nach einer Blutung die Erythropoiese zu beschleunigen. Die wichtigsten EPO exprimierenden Zellen (Fibroblasten) befinden sich in der Nierenrinde. Die Lage dort ist gut für die regulierte Produktion des Hormons geeignet: Der O2-Partialdruck (pO2) in der Nierenrinde wird durch Änderungen der Herzleistung kaum beeinflusst, da der renale O2-Verbrauch mit dem Blutfluss korreliert (15).
Die basale EPO-Konzentration im Blutplasma beträgt 6- 32 IE/L (~ 10-11 mol/L) (28). Die Normalwerte zeigen eine große interindividuelle Variabilität. Signifikante Gender- oder Alters-Unterschiede sind nicht feststellbar. Bemerkenswert sind Tagesschwankungen, mit einem Tiefpunkt in den Morgenstunden, der sich bei Trainierten wie bei Untrainierten zeigen lässt (36). Die EPO-Konzentration zeigt einen exponentiellen Anstieg (bei Frauen und Männern gleichermaßen (33)), wenn der [Hb]-Wert unter ca. 125 g/L abgefallen ist. Dieser exponentielle EPO-Anstieg fehlt bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz oder chronisch entzündlichen Erkrankungen.
EPO mRNA ist auch in anderen Organen (z.B. Leber, Milz und Gehirn) nachweisbar, aber diese Organe können die endokrine Funktion insuffizienter Nieren nicht ersetzen. Interessant ist die Hypothese, dass EPO im Gehirn parakrin neuroprotektiv wirksam ist (52, 65).
Der Anstieg der EPO-Konzentration im Blut infolge Anämie oder anderer Formen von Hypoxie (O2-Mangel) verhält sich dynamisch, mit anfänglich sehr hohen Werten, die abfallen, bevor die O2-Versorgung normalisiert ist. Die EPO-Konzentration hängt nicht nur von der Rate der EPO-Produktion, sondern auch von der EPOElimination durch seine Zielzellen ab (30). Folglich ist die EPO-Konzentration bei Knochenmarkhypoplasie viel höher (10000 IE/L oder mehr) als bei Anämien anderer Ursache.
Die Behandlung gesunder Personen mit rekombinantem humanem EPO (rHuEPO) erzeugt eine Zunahme der Masse roter Blutzellen (zur Dopingproblematik, s. (32)). Gleichzeitig nimmt das Blutplasma-Volumen ab, so dass das Blutvolumen sich kaum ändert. Damit führt die Gabe von rHuEPO über zwei Mechanismen zur Erhöhung des [Hb]-Wertes: Einerseits nimmt die ErythrozytenMasse zu und andererseits das Blutplasma-Volumen ab (44). Das erythropoietische System ist mit dem Renin-Angiotensin(Ang)-System verknüpft (10). Ang II steigert über Ang II Typ 1-Rezeptoren die Produktion von EPO (20) und die Proliferation erythrozytärer Vorläufer (71).
Da die EPO-Produktion von der O2-Versorgung des Organismus abhängt, wird EPO auch aktiviert, wenn der pO2 im arteriellen Blut absinkt oder die O2-Affinität des Hb zunimmt. In großer Höhe ist der inspiratorische pO2 vermindert, so dass auch der Gewebe pO2 abnimmt. Bei simulierter Höhe von 4000 m ist in Normalpersonen bereits nach ca. 1,5 h ein signifikanter Anstieg der EPO-Konzentration im Blut nachweisbar (11). Die EPO-Konzentration erreicht nach 1- 2 Tagen Spitzenwerte und fällt dann auf ein neues Plateau (vgl. (35)). Entsprechend ist die EPO-Konzentration bei Bewohnern mäßiger Höhenlagen (z.B. 2600 m) gegenüber der bei Tieflandbewohnern nicht signifikant erhöht (5). Schmidt et al. (62) haben jedoch darauf hingewiesen, dass die EPO-Konzentrationen höher als normal sind, wenn sie auf die – angestiegenen – [Hb]- bzw. HktWerte der Höhenbewohner bezogen werden. Hinsichtlich anderer Erythropoiese fördernder Hormone wurde gezeigt, dass Aufenthalt in 2315 m Höhe nicht zu einem Anstieg von Thyreotropin, T3 und T4 (21) und Aufenthalt in 6542 m Höhe nicht zu einem Anstieg von IGF-1 (60) im Blut führt.
Rolle extrarenaler O2-Sensoren
Möglicherweise wird die EPO-Synthese in den Nieren durch O2-Sensoren im Gehirn beeinflusst. Lokale Hypoxie des Hirnstamms stimuliert in Versuchstieren die renale EPO-Produktion (72). Nach einer anderen Hypothese führt eine vermehrte Durchblutung der Haut zu einer Verschlechterung der renalen O2-Versorgung, so dass die EPO-Expression ansteigt (6). Allerdings ist dieses Konzept nicht allgemein anerkannt (55), unter anderem, weil der renale Blutfluss kein wichtiger Parameter der renalen EPO-Synthese ist (54). Eine isolierte Hypoxie der Haut führt beim Menschen nicht zum Anstieg der EPO-Konzentration im Blut (57). Auch eine Mehrdurchblutung der Muskulatur (z.B. bei körperlicher Arbeit) hat keinen bekannten Einfluss auf die EPO-Produktion (z.B. Fahrradergometerstudien von Schmidt et al. (61, 62)). In diesem Zusammenhang muss aber an die wichtigen Befunde von Morici et al. (48) erinnert werden, die gezeigt haben, dass supramaximales Training (Rudern, Laufen, Gewichtheben) zu einem akuten Anstieg der Konzentration hämopoietischer Stamm- und Vorläuferzellen sowie unreifer Retikulozyten im Blut führt.
Die Nierennerven sind für die O2-abhängige EPO-Expression in der Niere nicht essentiell (12). Die Rolle humoraler Botenstoffe ist streitig. Einzige Ausnahme sind die Schilddrüsenhormone T3 und T4, welche in in vitro Modellen die EPO-Bildung – möglicherweise über Steigerung des O2-Verbrauchs – stimulieren (16). Therapieversuche am Menschen sind hierzu nicht bekannt. Dagegen wurde gezeigt, dass die Infusion von Somatotropin in anämischen niereninsuffizienten Patienten die Plasma-EPO-Konzentration erhöht (67). Ein derartiger Effekt ist bei Normalpersonen nicht bekannt. Die Verabreichung von Testosteron bewirkt gleichfalls keinen Anstieg der EPO-Konzentration (8, 45). Fisher (17) hat für Interessierte ausführlich zahlreiche andere humorale Faktoren (z.B. Adenosin und Prostanoide), die möglicherweise die EPO-Produktion beeinflussen, diskutiert.
Molekulare Mechanismen der Hypoxie-induzierten EPO-Expression
Die EPO-Synthese wird durch Transkriptionsfaktoren kontrolliert. Der EPO-Promotor wird unter normoxischen Bedingungen von GATA-2 inhibiert (69). Diese Inhibition wird aufgehoben, wenn GATA-2 unter hypoxischen Bedingungen verschwindet (26). Die Zytokine Interleukin-1 und Tumor-Nekrose-Faktor-∝ induzieren GATA-2 (40), dies erklärt den EPO-Mangel bei chronisch entzündlichen und malignen Erkrankungen (vgl. (29)). Der missbräuchliche Einsatz von GATA-Inhibitoren ist im Sport denkbar. Es handelt sich um in silico herstellbare, kleinmolekulare und oral wirksame Stoffe (Diazepan-Derivate) (50). Der GATA-Inaktivator K-11706 stimuliert im Versuchstier die Erythropoiese und steigert so innerhalb weniger Tage die Ausdauerleistungsfähigkeit beträchtlich (25).
Eine besonders wichtige Kontrollinstanz für die EPO-Expression ist der EPO-Enhancer. Er wird durch Hypoxie induzierbare Transkriptionsfaktoren (HIF) aktiviert. HIF sind ubiquitäre Proteine aus zwei Untereinheiten: dem nur unter hypoxischen Bedingungen detektierbaren HIF-∝ (120 kDa; Isoformen -1∝, -2∝ und -3∝) und dem konstitutiv vorhandenen HIF-1∝ (90-95 kDa). Obwohl der Prototyp HIF-1 in EPO-Expressionsstudien entdeckt wurde (73), wird heute angenommen, dass HIF-2 der wichtigste Transkriptionsfaktor für EPO ist (56, 74). Der C-Terminus der HIF-∝ Untereinheiten hat O2-labile Bereiche (“O2-dependent degradation domains“, O-DDD), in denen Prolylreste hydroxyliert werden (Pro405 und Pro531 in HIF-2∝), wenn O2 vorhanden ist (14). Prolyl-hydroxyliertes HIF-∝ wird sofort vom von-Hippel-Lindau Tumor Suppressor-Protein (VHL) mit einer E3-Ligase markiert und proteasomal abgebaut (53). HIF sind nicht nur für die hypoxische EPO-Expression verantwortlich, sondern steuern auch andere Gene für Proteine, die den Organismus vor O2- und Glukosemangel schützen (Übersicht bei (64)). HIF-2 ist z.B. an der Regulation des Eisenhaushaltes beteiligt, so dass EPO-Synthese und Eisen-Homöostase unmittelbar gekoppelt sind (34). Außerdem stimulieren HIF die Expression von Genen für gefäßwirksame Mediatoren, wie z.B. den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF).
Die HIF-∝ Hydroxylierung wird durch spezifische Prolyl-4-Hydroxylasen katalysiert (PHD-1, -2 und -3), welche ein O-Atom von O2 auf den Prolylrest und das andere auf α-Ketoglutarat übertragen, wobei CO2 und Succinat entsteht (vgl. (7)). PHD-2 und PHD-3 sind selbst HIF-Zielgene, deren Expression bei Hypoxie zunimmt, so dass HIF-∝ während langfristiger hypoxischer Perioden beschleunigt hydroxyliert wird. Dieser negative “Feedback“-Mechanismus könnte die oben angesprochene Abnahme der EPO-Produktion bei andauernder Hypoxie mitverursachen (68). Außerdem katalysiert der sog. "Factor Inhibiting HIF-1" (FIH-1) (47) eine Asparaginyl-Hydroxylierung der HIF-∝ Untereinheiten (Asn847 in HIF-2∝),wodurch die Bindung des transkriptionellen Co-Aktivators “CREB-Binding Protein“ (CBP)/p300 verhindert wird (63). Laut in-vitro-Messungen sind die Dissoziationskonstanten der Enzym-Substrat-Komplexe („Km-Werte“) der drei PHD für O2 (≈ 170 mm Hg) oberhalb des arteriellen pO2 (90- 100 mm Hg), während FIH bei niedrigeren pO2-Werten (Km ≈ 60 mm Hg) arbeitet (38). Dies legt nahe, dass die HIF-∝ PHD die primären O2-Sensoren in der Regulation der EPO-Produktion sind.
Eisenchelatoren und ∝-Ketoglutarat-Kompetitoren hemmen die Aktivität der HIF-αHydroxylasen und steigern damit die HIFabhängige Genexpression unter normoxischen Bedingungen. Die Entdeckung, dass Fe2+ für die HIF-∝ Inaktivierung erforderlich ist, erklärt die erhöhten Plasma-EPO-Spiegel nach Gabe des Eisenchelators Desferrioxamin (37, 59). Kobaltsalz (Co2+) stimuliert die EPO-Expression ebenfalls durch Hemmung der HIF-∝ Hydroxylierung (27). Verschiedene ∝-Ketoglutarat-Kompetitoren („HIF-Stabilisatoren") werden als Antianämika getestet, sie haben einfache Strukturen und sind oral wirksam (18, 49, 51). Der HIF-Stabilisator FG-2216 (Fa. Fibrogen) erhöhte in einer Phase-I-Studie bei einmaliger Gabe die EPO-Konzentration im Blut auf ein Mehrfaches des Ausgangswertes (3). Der Wirkstoff FG-4592 war in Phase-II-Studien erfolgreich: Chronisch Nierenkranke zeigten Dosis abhängig einen [Hb]-Anstieg. Das Konkurrenzprodukt GSK1278863 (Fa. GlaxoSmithKline) wird momentan in Phase-II-Studien auf Sicherheit und Wirksamkeit bei wiederholten Applikationen getestet. Auch AKB-6548 (Fa. Akebia Therapeutics) hat die Phase-I der klinischen Entwicklung abgeschlossen: Der Wirkstoff erhöhte die EPO-Spiegel ohne schwerwiegende unerwünschte Reaktionen. Es muss jedoch daran erinnert werden, dass HIF-Stabilisatoren die Synthese zahlreicher Proteine steigern (49, 64). Damit wird möglicherweise das Wachstum von Tumoren, für die Nährstoffversorgung und anaerobe Glykolyse essenziell sind, gefördert (58). Die Vielzahl der chemischen Stoffe, welche die EPO-Expression steigern können, erschwert ihren Nachweis im Urin dopender Sportler(innen) (4).
PATHOPHYSIOLOGIE
EPO-Überproduktion
Wenn die Erythropoiese längere Zeit über den Bedarf gesteigert ist entwickelt sich das Bild einer Erythrozytose (syn. Polyzythämie). Erythrozytenzahl, [Hb]- und Hkt-Werte sind abnormal hoch (vgl. (24)). Bei einer sekundären Erythrozytose beruht die Störung auf einer EPO-Überproduktion. Diese wird am häufigsten durch Hypoxämien bei Höhenaufenthalt verursacht, d.h., sie ist erworben. Theoretisch könnte eine Zunahme des [Hb]-Wertes und damit der O2-Kapazität des Blutes sich positiv auf die O2-Versorgung des Gewebes auswirken. Mit dem Hkt nimmt jedoch auch die Viskosität des Blutes zu, die kardiale Nachlast steigt, und die Mikrozirkulation ist behindert (9). Die sekundäre Erythrozytose ist ein wichtiger pathogenetischer Faktor bei der chronischen Bergkrankheit, die auf einer Hypoxämie und pulmonaler Hypertension beruht. Die gesteigerte EPO-Produktion bei Höhenbewohnern (2) ist eine „maladaptive Reaktion“, mit Risiken für thromboembolische Ereignisse und Mortalität. Interessanterweise hat es evolutionsbiologisch unterschiedliche genetische Anpassungen der Menschen an die Höhe gegeben (23). Tibeter, die in etwa 4000 m Höhe leben, haben relativ niedrige [Hb]-Werte (75), während die südamerikanischen eingeborenen Höhenbewohner häufig unter der chronischen Bergkrankheit leiden (42). Bei tibetischen Höhenbewohnern konnten 31 HIF-2∝ Einzelnukleotid-Polymorphismen (“Single Nucleotide Polymorphisms“, SNPs) identifiziert werden, die mit den [Hb]-Werten korrelieren (1).
EPO-Mangel
EPO-Mangel ist die Hauptursache renaler Anämien (vgl. (22)). Die Dialysebehandlung ersetzt die Ausscheidungsfunktion der Nieren, aber nicht die Hormonproduktion. Chronisch Nierenkranke im Prä-Dialyse- und im Dialyse-Stadium werden routinemäßig mit rHuEPO oder einem Analogon behandelt. In Deutschland haben – abhängig vom jeweiligen Handelspräparat – rHuEPO und seine Analoga auch folgende zugelassene Indikationen: symptomatische Anämie bei erwachsenen Tumorpatienten mit Chemotherapie, Unterstützung der autologen Blutentnahme, elektive Operation und Anämie bei Frühgeborenen. Als Ziel-[Hb]-Wert wird bei Nierenkranken und Tumorpatienten allgemein 100- 120 g/L angestrebt (43). Die US Food and Drug Administration (FDA) hat kürzlich gewarnt, dass ab [Hb]-Werten >110 g/L das Risiko, schwere unerwünschte kardiovaskuläre Reaktionen (z.B. Schlaganfall) zu entwickeln, erhöht ist, und die Mortalität zunimmt (http://www.fda.gov/drugs/drugsafety/ucm259639.htm). Dies sollte Grund genug sein, rHuEPO und seine Analoga auf keinen Fall als Dopingmittel zu missbrauchen.
Angaben zu finanziellen Interessen und Beziehungen, wie Patente, Honorare oder Unterstützung durch Firmen: keine.
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Prof. Dr. med. Wolfgang Jelkmann
Universität zu Lübeck
Institut für Physiologie
Ratzeburger Allee 160
23562 Lübeck
E-Mail: jelkmann@physio.uni-luebeck.de