DZSM

Listed in:

  • Research Alert
  • Focus On: Sports Science & Medicine
  • SciVerse Scopus
  • CrossRef
  • EBSCO SPORTDiscus
  • Google Scholar
  • Chemical Abstracts Service

The German Journal of Sports Medicine is directed to translational science and clinical practice of Sports Medicine and its adjacent fields, which investigate the influence of physical activity, exercise, training and sports, as well as a lack of exercise affecting healthy people and patients of all age-groups. It addresses implications for prevention, diagnosis, therapy, rehabilitation and physical training as well as the entire Sports Medicine and research in sports science, physiology and biomechanics.

The Journal is the leading and most widely read German journal in the field of Sports Medicine. Readers are physicians, physiologists and sports scientists as well as physiotherapists, coaches, sport managers, and athletes. The journal offers to the scientific community online open access to its scientific content and online communication platform.

. .


Sportmedizin
ORIGINALIA
RETIKULOZYTEN: REFERENZWERTE UND METHODENVERGLEICHE

Retikulozyten: Untersuchungen zur Referenzwertermittlung und zum Vergleich unterschiedlicher Laboranalysegeräte

Reticulocytes: Reference Range and Comparison of Different Laboratory Devices

ZUSAMMENFASSUNG

Ziele  dieser  Studie  waren  die  Ermittlung  von  Referenzwerten  für  Retikulozyten [%RET]  bei  jungen  Athleten  (Alter  16,7±3,5  Jahre)  und  der  Vergleich  von Messwerten  verschiedener  Laboranalysegeräte:  Sysmex  R500,  Sysmex  XT-2000i (beide Sysmex, Norderstedt) und ADVIA 120 (Bayer HealthCare, Fernwald). Der Einfluss geräteabhängiger Messunterschiede auf Referenzwerte sollte geprüft und vor dem Hintergrund bestehender Grenzwerte unterschiedlicher Sportverbände diskutiert werden. In einer Querschnittsuntersuchung wurden 428 Kaderathleten verschiedener Sportarten hinsichtlich %RET mit Hilfe des Sysmex R500 untersucht. Der ermittelte Referenzbereich betrug 0,60–1,82 % RET. In drei Vergleichsstudien wurden Blutproben an jeweils zwei verschiedenen Laborgeräten analysiert. Der Sysmex R500 diente als Referenzgerät. In den ersten beiden Studien wurden die Ergebnisse mit denen des ADVIA 120 verglichen. Sie korrelierten mit r = 0,61 für die erste bzw. r = 0,82 für die zweite Studie. Die Messergebnisse des ADVIA 120 lagen um 0,33 (1. Studie) bzw. 0,30 (2. Studie) für %RET höher als die des R500. Die dritte Vergleichsstudie (Referenzgerät vs. Sysmex XT-2000i) ergab für %RET einen Zusammenhang von r = 0,76. Die Ergebnisse des XT-2000i lagen um 0,21% RET tiefer als die des Referenzgerätes. Fazit: Referenzwerte und Grenzwerte für %RET  sowie  Analysen  zur  Dopingkontrolle  oder  Blutprofil-Erstellung  müssen mit  Blick  auf  die  verwendete  Messtechnik  interpretiert  werden.  Im  Sinne  von Dopingkontrollen  sollte  es  Ziel  sein,  eine  höchstmögliche  Standardisierung  zu erzielen.

Schlüsselwörter: Grenzwerte, Blutdopingkontrolle, Sysmex R500, ADVIA 120, Sysmex XT-2000i.

SUMMARY

The  goals  of  the  study  were:  Establishment  of  reference  values  of  reticulocytes [%  RET]  in  young  athletes  (age  16.7±3.5  yrs)  and  the  comparison  of  data  from three different laboratory machines Sysmex R500, Sysmex XT-2000i (both Sysmex, Norderstedt) and ADVIA 120 (Bayer HealthCare, Fernwald). Further goals were to analyze the device dependent influence on current reference values especially with the background of different threshold values of sport federations. For this purpose %RET from 428 squad athletes of different sport disciplines was measured. The determined  reference  range  was  0.60–1.82%  RET.  Within  three  comparative studies,  blood  samples  were  analyzed  in  two  different  laboratory  devices.  The R500  (Sysmex)  functioned  as  reference  device.  In  the  first  two  studies  the  data were compared to the ADVIA 120 (Bayer) device. Data correlated with r = 0.61 in the first and 0.82 in the second study. The data from the ADVIA 120 were 0.33 %RET (1st study) and 0.3% RET (2nd study) higher compared to R500. The third comparative study (reference device vs. Sysmex XT-2000i) showed a correlation of r = 0.76 for %RET. In average, the data from XT-2000i were 0.21% RET lower compared to the reference value. Conclusion: Reference and threshold values of %RET for doping and blood-profile analysis are depending on the measurement technique. For means of doping analysis, the goal should be to achieve the highest standardization procedures.

Key Words: cut off limits, blood doping, Sysmex R500, ADVIA 120, Sysmex XT-2000i.

PROBLEM- UND ZIELSTELLUNG

Im Ausdauersport ist die aerobe Energiegewinnung eine limitierende Größe und wesentlich von der Sauerstofftransportleistung des Blutes  abhängig.  Hierbei  ist  das  in  den  Erythrozyten  enthaltene Hämoglobin von besonderer Bedeutung und stellt die Grundlage für die Sauerstoffversorgung der Muskulatur dar. Die Neubildung der Erythrozyten wird in erster Linie von Erythropoietin (EPO) beeinflusst.  Die  adulte  Erythropoese  findet  ausschließlich  im  Knochenmark statt und dauert insgesamt ca. 7 Tage. Peripher zirkulierende Erythrozyten haben eine Lebensdauer von 120 Tagen. Etwa 1% wird täglich abgebaut; jede Sekunde werden ca. zwei Millionen Zellen neu gebildet. Der Retikulozyt stellt im peripherem Blut die letzte  unreife  Vorstufe  der  Erythrozyten  dar  (29).  Eine  erhöhte Retikulozytenanzahl kann somit als Indikator für eine gesteigerte Erythropoese  interpretiert  werden.  Sowohl  auf  physiologischem als  auch  auf  manipulativen  Weg  lässt  sich  die  Bildung  der  Erythrozyten  über  EPO  stimulieren  (1, 10, 17, 28).  Die  Manipulation durch Eigenblut hingegen kann die Erythropoese herunter regulieren  und  damit  die  Anzahl  der  Retikulozyten  herabsetzen.  Die Internationale  Eisschnelllauf  Union  (ISU)  beispielsweise  hat  für den  prozentualen  Retikulozytenanteil  [%RET]  einen  Grenzwert festgelegt. Angelehnt an Referenzwerte (üblicherweise 95%- Konfidenzintervall einer Stichprobe, bei der davon ausgegangen wird, dass  sie  aus  Gesunden  besteht)  liegt  die  obere  Grenze  bei  2,4% RET und die untere bei 0,2% RET. Das Internationale Olympische Komitee  (IOC)  hat  erstmals  2002  mit  einem  oberen  Grenzwert von 2,0% RET gearbeitet. Der Sinn der Grenzwerte liegt zum einen im Schutz der Sportler und zum anderen darin, Manipulationen durch  Doping  entgegenzuwirken  (28).  Bei  Überschreitung  der Grenzwerte  sollen  weitere  Untersuchungen  zum  direkten  Nachweis  von  rekombinantem  Erythropoietin  (rhEPO)  aus  dem  Urin folgen und es drohen Sanktionen. Internationale Verbände sprachen in der Vergangenheit Schutzsperren (Startsperren) während der Wettkampfteilnahme und auch längerfristige Wettkampfsperren aus, die nicht selten berufliche und persönliche Konsequenzen zur Folge hatten.
Vor  diesem  Hintergrund  hat  die  Kenntnis  über  individuelle Variabilitäten von Biomarkern in den letzten Jahren große Bedeutung  erhalten  und  führte  zu  der  Einführung  eines  sogenannten Blutpasses.  Über  langjährige  Blutanalysen  eines  Sportlers  sollen Schwankungsbereiche  erkannt  und  Aussagen  zu  Abweichungen vom  individuellen  Range  eines  Biomarkers  ermöglicht  werden (6, 8, 9, 23, 25, 35).  Neben  biologischen  Einflüssen  können  jedoch methodisch-abnahmebedingte Faktoren nicht nur zu einer interindividuellen  sondern  auch  zu  einer  intra-individuellen  Varianz der analysierten Blutparameter beitragen. Beide Quellen von Variabilitäten sind also aufgrund der erheblichen Konsequenzen für die Aktiven von großer Bedeutung (6).
Die hier vorgestellten Daten zeigen Ergebnisse aus drei Untersuchungen,  bei  denen  Retikulozytenmessungen  mit  jeweils zwei  unterschiedlichen  Geräten  durchgeführt  wurden.  Ziel  war einerseits, zu prüfen, wie vergleichbar die Ergebnisse sind und andererseits, mögliche systematische Messabweichungen zu quantifizieren,  um  sie  im  Zusammenhang  mit  Grenzwerten  diskutieren zu können. Zunächst werden Daten vorgestellt, die aus einer Querschnittsuntersuchung von Kaderathleten stammen, um Aussagen über deren Referenzbereich machen zu können. Mittels der Ergebnisse aus den drei Studien zum Gerätevergleich soll der Frage nachgegangen werden, wie hoch der Einfluss der angewandten Messmethode auf Referenzbereiche sein kann.

MATERIAL UND METHODEN

Studie zur Referenzwertermittlung
In  der  Querschnittsuntersuchung  (QU)  wurden  hämatologische Parameter  von  428  Kaderathleten  verschiedener  Sportarten (männlich: 203, Durchschnittsalter mit Standardabweichung: 17,2 ±3,6 Jahre, Größe: 181,1±10,3 cm, Gewicht: 74,0±15,1 kg; weiblich: 225, Alter: 16,2±3,3 Jahre, Größe: 167,7±9,7 cm, Gewicht: 57,7±10,7 kg) erhoben.

Studien zum Vergleich verschiedener Geräte
Die  Daten  der  ersten  Studie  (sleep-high  train  low  =  SHTL)  zum Vergleich unterschiedlicher Analysegeräte wurden während einer Untersuchung  zur  Höhentrainingsmethode  sleep-high  train-low in einer Höhenkammer gesammelt (durch Sauerstoffentzug in der Kammer wurde eine Schlafhöhe von ca. 2500 m ü. NN bei normalem Luftdruck simuliert). Es nahmen 9 männliche Probanden aus unterschiedlichen  Sportarten  teil  (Alter:  24,0±1,8  Jahre,  Größe: 176,6 cm±3,4 cm, Gewicht: 69,0±6,3 kg), deren Blutproben in den ersten zwei Wochen der Studie an zwei Geräten gemessen wurden (n = 34).
Der  Datenpool  (n  =  120)  der  zweiten  Vergleichsstudie  (VS) stammt aus einer einjährigen Vergleichsmessung mit Proben eines von der WADA akkreditierten Institutes.
Die Blutproben wurden durch die Nationale-Anti-Doping-Agentur (NADA) innerhalb ihrer Tätigkeit entnommen und für diese Studie anonymisiert, so dass keine anthropometrischen Daten vorliegen. Die Blutproben (n = 55) der dritten Vergleichsstudie wurden während  einer  Interventionsstudie  (IST)  entnommen,  bei  der5  männliche  Probanden  definierte  intensive  Trainingseinheiten (ca.  80%  der  maximalen  individuellen  Herzfrequenz  auf  NN)  in einer  Höhenkammer   (simulierte  Höhe:  ca.  3000  m  ü.  NN)  absolvierten  (Alter:  30,0±7,7  Jahre,  Größe:  179,5±6,7  cm,  Gewicht: 72,2±3,1 kg).

Probennahme und Geräte
Die Analysen zur Referenzwerteermittlung wurden mit dem Sysmex R500 (Sysmex, Norderstedt, Deutschland) durchgeführt.
In den Untersuchungen zum Vergleich verschiedener Geräte diente der Sysmex R500 als Referenzgerät. Nach Dimopoulou et al. (15) ist es ein präzises und aufgrund seiner geringen Größe sehr gut zu transportierendes Analysegerät und somit für Feldstudien und Trainingslager besonders gut geeignet. In den beiden ersten Studien wurde dem Referenzgerät der ADVIA 120 (Bayer HealthCare, Fernwald, Deutschland) gegenübergestellt und in der dritten Studie der Sysmex XT-2000i (Sysmex, Norderstedt, Deutschland). Letzteres  wird  von  der  WADA  in  den  Blutpassprogrammen  eingesetzt  und  ist  ausschließlich  für  die  beteiligten  Laboratorien zugelassen.
Die  Messmethode  des  Sysmex  R500  zur  Bestimmung  der Retikulozyten  basiert  auf  der  Anfärbung  der  restlichen  RNA  der erythroiden Blutzelle mit einem Polymethin-Fluoreszenzfarbstoff. Die Blutprobe wird nach Anfärbung durchfluss-zytometrisch auf Streulichtverhalten und Fluoreszenzintensität analysiert. Der Hersteller gibt für die Präzision der Messung einen Variationskoeffizienten (VK) von ≤15% bei 1,0–4,0% RET an. Der ADVIA 120 färbt die zuvor aufgekugelten Zellen mit dem Chromogen Oxazin 750 und führt eine Lichtabsorbtionsmessung durch. In Abhängigkeit von ihrem RNA-Gehalt können die Zellen in 3 verschiedene Reifungsgrade unterschieden werden. Die Präzision der Messungen wird mit einem VK von 12,5% beschrieben. Der Sysmex XT-2000i zählt  und  differenziert  mit  moderner  Fluoreszenz-Durchflusszytometrie (Färbung der RNA der Retikulozyten mit Polymethin) mit einer angegebenen Präzision wie die des Vorgängermodells R500.
Die Funktion der Geräte wurde an jedem Messtag durch Qualitätskontrollen geprüft.
Während aller vier Studien wurde venöses Blut bei sitzender Position der Probanden entnommen und zeitnah analysiert. Die Retikulozyten  werden  im  Folgenden  ausschließlich  bezogen  auf ihren  Anteil  an  Erythrozyten  angeben  [%RET],  obwohl  alle  Geräte auch die absoluten Retikulozytenzahlen einer Probe messen [RET 106/µL], diese jedoch weniger in Zusammenhang mit Grenzwerten stehen.

Statistik
Für die Daten werden Mittelwert ( ), Median, Minimum (Min), Maximum  (Max)  und  Standardabweichung  (SD)  angegeben;  außerdem  das  95%- Konfidenzintervall  (MW±1,96  x  SD).  Signifikante Unterschiede  der  Daten  zur  Referenzwertermittlung  wurden  mit dem t-Test und der zweifaktoriellen Varianzanalyse geprüft; die der Studie zum Gerätevergleich mit dem t-Test für gepaarte Stichproben. Das Signifikanzniveau wurde für eine Irrtumswahrscheinlichkeit  p<0,05  angesetzt.  Die  Ergebnisse  der  Vergleichsstudien  werden außerdem in Regressionen mit Korrelationskoeffizienten nach Pearson (r) und Bland-Altman-Plots (BAP) dargestellt.

ERGEBNISSE

Referenzwertermittlung
Die Häufigkeitsverteilung von %RET der QU mit 428 Kaderathleten verschiedener Sportarten ist in Abb. 1 dargestellt. Für  wurde 1,09 %RET  (±0,32  SD)  ermittelt;  der  Median  liegt  bei  1,03%  RET.  Der niedrigste Wert beträgt 0,45 und der höchste 2,59% RET.
Die  Verteilungskurve  zeigt  eine  für  medizinische  Merkmale typische  Rechtsschiefe  und  folgt  einer  Lognormalverteilung.  Die Ermittlung des  Referenzbereiches (95%- Konfidenzintervall) wurde an den logarithmisch transformierten Daten durchgeführt. 95% der Werte liegen hiernach zwischen 0,60–1,82%RET.
Obwohl  Referenzwerte  für  Retikulozyten  in  medizinischer Fachliteratur  selten  nach  Geschlecht  oder  Alter  (Ausnahme  sind Werte für Säuglinge) differenziert angegeben werden (16, 20, 21, 39), sind die in dieser Studie ermittelten Werte hinsichtlich dieser Kriterien  auf  signifikante  Unterschiede  geprüft  worden.  Die  Werte der männlichen (n = 203,  = 1,07%RET) und weiblichen (n = 225, = 1,10%RET) Athleten unterscheiden sich statistisch nicht (p = 0,41).  Die  Bildung  der  Klassen  nach  Alter  und  Geschlecht  wurde von  der  Anzahl  der  Stichproben  abhängig  gemacht  (Abb.  2).  Es konnte kein signifikanter Unterschied ermittelt werden (p = 0,74). Außerdem erfolgte die Unterscheidung nach Sportarten. Hier liegt ebenfalls kein statistisch signifikanter Unterschied vor (p = 0,27 für geschlechtsunabhängig, wie in Abb. 2 dargestellt und p = 0,22 für geschlechtsabhängig).

Messmethodische Variabilitäten
Die Maße der Korrelationen und Unterschiede von %RET der drei Vergleichsstudien  mit  jeweils  zwei  verschiedenen  Messgeräten sind  in  Abb.  3  graphisch  dargestellt.  Im  BAP  sind  die  absoluten Abweichungen der Ergebnisse abgebildet. Auf der x-Achse sind die gepaarten  Mittelwerte  einer  Probe,  gemessen  mit  zwei  Geräten und auf der y-Achse deren absoluten Differenzen aufgetragen.
Für  die  Ergebnisse  der  ersten  Studie  SHTL  zum  Vergleich zweier  Geräte  (Sysmex  R500  vs.  ADVIA  120)  wurde  ein  statistischer  Zusammenhang  von  r  =  0,61  ermittelt.  Im  BAP  ist  zu erkennen, dass ein Gerät systematisch höhere Werte erzielte als das  andere.  Die  Ergebnisse  des  ADVIA  120  lagen  im  Mittel  um 0,33%RET höher als die des Sysmex R500. Das 95%-Konfidenzintervall der Differenzen verläuft von -0,90–0,25%RET. Die höchsten Differenzen der Graphik betragen 1,01 und 1,04%RET. Der Unterschied  (Sysmex  R500: =  1,32%RET  und  ADVIA  120: = 1,64%RET) kann als statistisch signifikant nachgewiesen werden (p =<0,002).
Die statistische Analyse der zweiten Vergleichsstudie (VS) zeigt einen Zusammenhang von r = 0,82 (Sysmex R500 vs. ADVIA 120). Im BAP kann jedoch erneut dargestellt werden, dass der ADVIA 120 systematisch  höhere  Messergebnisse  analysierte  als  der  Sysmex R500. Die Ergebnisse (Sysmex R500: = 1,11%RET und ADVIA 120: = 1,42%RET) sind statistisch signifikant unterschiedlich (p<0,001). Im  Mittel  liegen  die  Ergebnisse  des  ADVIA  120  um  0,30%  höher als die des Sysmex R500. Das 95%-Konfidenzintervall verläuft von -0,78–0,18 % RET. Die in der Graphik erkennbaren Differenzen außerhalb dieses Bereiches betragen -1,15, - 0,89 und -0,88%RET. Die Punktwolke weist in der Mitte die höchste Streuung auf.

Für die Daten der IST wurde ein statistischer Zusammenhang von  r  =  0,76  ermittelt  (Sysmex  R500  vs.  Sysmex  XT-2000i).  Auch hier  ist  graphisch  ein  systematischer  Messunterschied  erkennbar (signifikant  mit  p  =<0,001).  Anders  als  beim  Vergleich  mit  dem ADVIA 120 liegen die Ergebnisse des Referenzgerätes Sysmex R500 ( = 1,22%RET) jedoch höher als die des Vergleichsgerätes Sysmex XT-2000i (= 1,02%RET). Der Mittelwert der Differenzen beträgt 0,21%RET. 95% der Differenzen liegen zwischen -0,02–0,42 %RET. Die  drei  in  der  Graphik  dargestellten  Differenzen  von  -0,51  -0,52 und -0,6%RET können als Ausreißer betrachtet werden. Der Median der Differenzen liegt bei 0,25%RET.

DISKUSSION

Referenzwertermittlung
In der medizinischen Diagnostik und zur Interpretation von Laborwerten werden Referenzwerte herangezogen. Zur Referenzwertermittlung wird eine entsprechend große Stichprobe von humanen Proben analysiert, von denen ausgegangen wird, dass sie von Gesunden stammen. Der Bereich des 95%- Konfidenzintervalles wird als der ermittelte Referenzbereich deklariert (2343). An dieser Stelle  sei  darauf  hingewiesen,  dass  der  heute  fast  allgemeingültige  Begriff  Referenzwert  den  Begriff  Normwert  ersetzt  hat.  Hier wird indirekt deutlich, dass Blutwerte erheblichen Schwankungen durch  verschiedene  Einflussfaktoren  unterliegen  können,  so  dass eine  Einstufung  in  “normal“  kaum  möglich  ist.  In  medizinischer Fachliteratur sind folgende Referenzwerte, ausgehend von einer gesunden, zum Teil geschlechtsunspezifischen, Stichprobe für %RET angegeben (Angaben zu Messmethoden wie vorhanden):

  • 0,8–2,0    bzw.    0,5–1,5    und    0,7–1,5    (mikroskopische    Zählung(12, 21, 39))
  • 0,5–2,0    (automatische    Zählung    (39))
  • 0,37–1,96;    0,53–2,18    (automatische    Zählung    mit    Fluoreszenzfarbstoff (22, 37))
  • 0,6–2,4    (20)
  • Frauen:    0,8    –4,1,    Männer:    0,8–2,5    (automatische    Zählung    mitFluoreszenzfarbstoffen (12, 16))

Mit  der  hier  vorgestellten  Studie  wurde  der  Frage  nachgegangen, ob  sich  ein  von  den  angegebenen  Bereichen  abweichender  Referenzbereich  für  junge  Nachwuchsathleten  ermitteln  lässt.  Ausgehend  vom  95%- Konfidenzintervall  der  vorliegenden  Daten,  kann ein von uns ermittelter Referenzwertebereich von 0,60–1,82%RET für  die  Grundgesamtheit  unserer  Stichprobe  angegeben  werden. Die  Ergebnisse  der  vorliegenden  Studie  unterscheiden  sich  somit nicht von den oben aufgeführten Referenzbereichen. Denkbar wäre ein  erhöhter  Referenzbereich,  da  gerade  bei  Ausdauersportarten Erythrozyten zerstört und diese durch junge Erythrozyten ersetzt werden, wie in einer drei wöchigen Studie auf dem Fahrradergometer (5 mal pro Woche für 45 Minuten) von Schmidt et al. nachgewiesen werden konnte (32). Aber auch Banfi et al. (7) ermittelten für 106 Athleten im Alter von 19 bis 35 Jahren einen Referenzbereich von 0,30 bis 1,54%RET ( = 0,81). Die Kontrollgruppe aus 73 gesunden Probanden wies einen Bereich von 0,26–1,79 (= 0,84) %RET auf,  der  sich  statistisch  nicht  von  dem  der  Athleten  unterschied. Morkeberg et al. (26) untersuchten in einer einjährigen Studie eine Fahrradmannschaft  hinsichtlich  ihrer  hämatologischen  Parameter. 374 Blutproben von 28 männlichen Probanden lagen zwischen 0,28–2,0%RET. In der Studie von Malcovati et al. (23) wurde für 923 Fußballspieler ein Referenzbereich von 0,53–1,47% RET ermittelt.

Innerhalb  unserer  untersuchten  Stichprobe  konnte  kein  Unterschied von %RET hinsichtlich der Sportarten statistisch ausgemacht werden. Dieser wäre möglicherweise z. B. zwischen Ausdauer- und Kraftsportarten durch unterschiedliche Trainingsmethoden und Anforderungen an die aerobe Leistungsfähigkeit zu erwarten. Trainingsreize  über  Hypoxie  oder  Höhenexpositionen  könnten gerade  bei  den  Ausdauersportarten  durch  eine  Aktivierung  der Erythropoese zu höheren %RET führen. Banfi et al. (7) konnten in ihrer Untersuchung ebenfalls keinen statistischen Unterschied von %RET von Athleten verschiedener Sportarten (Rugby, Fußball, Ski Alpin) ermitteln. Ashenden et al. (3) fanden keinen Unterschied von %RET  zwischen  den  Geschlechtern  und  den  Sportarten  Rudern und Fußball über einen mehrjährigen Untersuchungszeitraum.
Für  den  weiblichen  Anteil  der  Stichprobe  könnte  ein  vom Menstruationszyklus  beeinflusster  und  damit  altersabhängiger Anteil der Retikulozyten erwartet werden. Er deutet sich zwar graphisch an, kann jedoch nicht statistisch nachgewiesen werden, was mit den oben aufgeführten altersunabhängigen Angaben für %RET in der Literatur und mit den Ergebnissen einer Studie von Tarallo et al. übereinstimmt (38).
7 Athleten lagen mit 2,02–2,59% RET über dem seit den Olympischen  Winterspielen  2002  in  Salt  Lake  City  herangezogenen Grenzwert  von  2,0%RET.  Mögliche  Ursachen  können  sportliche Aktivität, die damit verbundene Zerstörung von Erythrozyten und Aktivierung der Erythropoese sein (31). Auch pathophysiologische Prozesse  können  Grund  einer  veränderten  Erythropoese  sein.  In der  Sportwissenschaft  steht  die  Hypoxie  als  physiologischer  Reiz zur  Steigerung  der  Erythropoese  und  damit  eine  mögliche  Verbesserung  der  aeroben  Leistungsfähigkeit  im  Vordergrund.  Das Höhentrainingslager ist für viele Ausdauersportler fester Bestandteil  im  Trainingsplan  (44, 45, 46).  In  den  letzten  Jahren  ist  jedoch auch  die  Blutmanipulation  unter  Ausdauersportlern  zu  einer öffentlichen  Diskussion  geworden.  Im  Fokus  stehen  dabei  autologe  und  homologe  Bluttransfusionen  sowie  die  Anwendung  von rekombinantem  Erythropoetin  (rhEPO).  Rekombinantes  Erythropoetin  kann  seit  der  Entwicklung  von  menschlichem  rhEPO  nur schwer nachgewiesen werden. Um kurzfristig und vor Ort schnell Aussagen machen zu können, sind hämatologische Parameter und ihre Referenzwerte von größter Bedeutung. Ein Befund über dem in Anlehnung an Referenzwerte ermittelten Grenzwert von >2,0% RET kann bei Olympischen Spielen zu einer weiteren Doping-Kontrolle führen, da der Verdacht einer unerlaubten EPO- Manipulation bestehen würde.

Messmethodische Variabilitäten
Vor  diesem  Hintergrund  ist  die  Kenntnis  gerätetechnisch  bedingter  Variabilitäten  von  %RET  unerlässlich,  denn  die  auf  dem Markt  erhältlichen  Messgeräte  bedienen  sich  unterschiedlicher Messmethoden (z.B. Anfärbung der RNA in den Retikulozyten mit Vital-,  Absorbtions-  oder  Fluoreszenzfarbstoffen  (11)).  Auch  andere Autoren machen in ihren Publikationen darauf aufmerksam, dass ihre Ergebnisse im Zusammenhang mit den Analysegeräten und  ihren  Messmethoden  zu  sehen  sind  (3, 6, 25, 39).  Hämatologische  Analysegeräte werden hauptsächlich durch die Herstellerfirma  kalibriert.  Die  fehlerfreie  Funktion  der  Geräte  kann  durch eine laborinterne Qualitätskontrolle geprüft werden. Eine weitere Kontrollmaßnahme  stellt  die  externe  Qualitätskontrolle  durch Ringversuche  dar.  Im  Gegensatz  zur  internen  Kontrolle,  bei  der Kontrollmaterial  mit  bekannter  Konzentration  zur  Verfügung steht, analysiert der Anwender die externe Kontrolle ohne Kenntnis der Messwertkonzentrationen bzw. Sollwerte. Die Ergebnisse werden  anschließend  in  Deutschland  nach  den  Richtlinien  der Bundesärztekammer (RiliBäk) von nach ISO 17 025 akkreditierten Referenzlaboratorien bewertet (z.B. DGKL und Instant e.V.). Von Bedeutung ist hier, dass ein- und demselben Ringversuch je nach Messmethode unterschiedliche Zielwerte und Referenzwerte (Bewertungsbereich)  zu  Grunde  liegen.  Unterschiedliche,  messmethodisch  bedingte  Ergebnisse  werden  somit  bei  Ringversuchen einkalkuliert. Hier wird deutlich, dass methodische Variabilitäten von geringerer klinischer Bedeutung sind, als sie es für einen Vergleich der Daten von  Athleten sein können. Gemessene Biomarker werden in der klinischen Diagnostik anhand von ausgewiesenenReferenzwerten in Abhängigkeit der Messtechnik in der Postanalytik vom Arzt bewertet. Liegt ein Messwert in der sogenannten Grauzone  (Übergang  vom  Referenzwert  zum  eindeutig  pathologischen  Wert)  können  weitere  Untersuchungen  zur  Diagnostik herangezogen  oder  Messungen  wiederholt  werden.  In  der  Regel werden  eine  Reihe  von  Probennahmen  und  Analysen  durchgeführt,  bevor  ein  eindeutiger  Befund  zur  Therapiegrundlage  vorliegt.  Dagegen  hat  bei  Athleten  ein  einmal  gemessener  %RET–Wert, der oberhalb eines Grenzwertes liegt, welcher unabhängig von  der  Messtechnik  festgelegt  wurde,  möglicherweise  direkte Konsequenzen zur Folge.
Der Vergleich zwischen den drei Geräten zeigt unterschiedlich  hohe  Korrelationen  (Tab.  1).  Eine  als  unbefriedigend  einzustufende  Korrelation  von  r  =  0,61  für  die  Daten  der  ersten  Vergleichsstudie  SHTL  hat  vermutlich  eine  Summierung  prä-  bzw. postanalytischer  Einflussfaktoren  als  Ursache,  die  jedoch  nicht dokumentiert wurden (s. hierzu (19)). Systematische Messunterschiede wurden im Bland-Altman-Plot deutlich gemacht und bestätigen  die  Hypothese  von  gerätebedingten  Messvariabilitäten. Folgendes kann demzufolge formuliert werden: Die Ergebnisse des ADVIA 120 lagen im Durchschnitt um 0,32%RET (Studie SHTL und VS) höher als die des Sysmex R500. Die Ergebnisse des Sysmex R500 lagen um 0,21% RET höher als die des Sysmex XT-2000i. Der in  unserer  Studie  (QU)  ermittelte  Referenzbereich  läge  mit  dem ADVIA 120 höher und mit dem Sysmex XT-2000i niedriger (Tab. 1). Die Anzahl von 7 Athleten der QU mit dem Sysmex R500, die über dem Grenzwert von %RET lagen, hätte sich bei einer Messung mit einem ADVIA 120 auf 22 erhöht und mit einem Sysmex XT-2000i auf 2 Athleten reduziert (Tab. 1). Als Folge bedeutet dies, dass sich im Ernstfall die Anzahl der sofort ausgesprochenen Schutzsperren während eines Wettkampfes erheblich unterscheiden würden. Auch Ashenden et al. untersuchten in ihrer Studie „intra-measurement“ Variabilitäten und fanden signifikant höhere Ergebnisse mit dem ADVIA 120 als mit dem Sysmex XE-2100 (3). Publizierte Daten von Morkeberg et al. stimmen in signifikant höheren Analysewerten des ADVIA 120 gegenüber dem Sysmex R500 mit unseren Ergebnissen überein (25). Butarello et al. (13) untersuchten mit fünf verschiedenen Geräten die Fraktion junger Retikulozyten (IRF) und kamen ebenfalls zu dem Ergebnis, dass deren Referenzbereich stark methodenabhängig ist. In einer weiteren Studie von Ashenden et al. wurden Messabweichungen elf verschiedener hämatologischer Analysegeräte  untersucht.  Die  Autoren  fanden  überwiegend  höhere Werte mit dem ADVIA 120 als mit auf  Fluoreszenzintensität basierenden  Messmethoden  (3).  In  einer  anderen  Studie  mit  317 Probanden (männlich: 142, weiblich: 175) sollten Referenzbereiche für Retikulozyten mit fünf Messgeräten ermittelt werden. Die Arbeitsgruppe Van den Bossche et al. wiesen hier geräteabhängige Referenzbereiche  für  %RET  aus,  die  auch  Thomas  in  einer  neueren  Fassung  seines  Standardwerkes  über  Bewertungen  von  Laborbefunden  für  die  medizinische  Diagnostik  aufnahm  (40, 41): 0,61–2,16  (AbX  Pentra  120  Retic);  0,61–1,79  (Coulter  Gen-S); 0,44–1,55  (Sysmex  SE  9500);  0,61–2,24  (Abbott  CD  4000)  und 0,50–1,40 (ADVIA 120).
Neben  den  automatischen  Bestimmungsmethoden  stellt  die manuelle  Zählmethode  der  Retikulozyten  (Verwendung  von  Vitalfarbstoffen) auch heute noch eine Alternative dar. Diese Methode ist jedoch unpräziser, und weist demzufolge höhere intra- und interlabor-Variabilitäten  auf  (intra-VK  von  10%,  23,6%  und  49% für hohe, normale und niedrige %RET und inter-VK von 25–50 %), als die automatische Zählmethode (14, 30, 39, 42). Zum einen werden  weitaus  weniger  Erythrozyten  hinsichtlich  der  Retikulozyten beurteilt und zum anderen spielt der subjektive Aspekt eine große Rolle.  Daneben  können  Vitalfarbstoffe  auch  andere  Bestandteile (Eiseneinschlüsse, denaturiertes Eiweiß) der Retikulozyten anfärben (5, 21). Es werden jedoch nicht grundsätzlich höhere Werte mit dem  Mikroskop  ermittelt  oder  höhere  Referenzwerte  angegeben (30, 39). Fluorochrome färben auch DNS, jedoch konnten wir entgegen der Theorie, dass Oxazin 750 (ADVIA 120) als nicht-fluoreszierender Farbstoff nur RNA färbt, keine höheren Werte mit dem Fluoreszenzverfahren ermitteln.
Es sei darauf hingewiesen, dass an dieser Stelle nicht geklärt werden kann, welche Messmethode sich dem wahren Wer t am ehesten annähert, da dies nicht Untersuchungsgegenstand war und nur mit  hoch  standardisierten  und  aufwendigen  Methoden  ermittelt werden kann. Die Varianz ermittelter Werte mit unterschiedlichen Messtechniken  ist  unter  Anwendern  eine  bekannte  Tatsache,  erhält jedoch bei der Interpretation von Ergebnissen oft zu wenig Beachtung. So wäre es ratsam, beispielsweise Datenbanken von Blutprofilen unbedingt durch die Dokumentation von Messgerät und -methode zu erweitern. Allem voran steht eine unabdingbare Standardisierung nicht nur der Blutentnahme in Bezug auf Körperstellung,  Tageszeit,  vorhergehende  Belastung  und  Höhenexposition, sondern auch in Bezug auf die verwendete Messapparatur (4, 36). Es sind nicht nur Kenntnisse über den Einfluss von Training, den Abnahmezeitpunkt (vor, während, nach Wettkampf), die Sportart und die intraindividuellen Variabilitäten von %RET besonders wichtig, sondern auch von Präanalytik und Messmethodik (4, 6, 25). Aus den Ergebnissen resultiert auch, dass derzeitig definierte Blutparameter und ihre festgelegten Grenzwerte zur Ermittlung von Veränderungen hämatologischer Eigenschaften, wie auch schon von anderen Autoren postuliert, nicht alleine als Indikatoren zur Ermittlung von  Blutmanipulationen  ausreichen  (33).  Neuere  direkte  (totale Hämoglobinmenge, eASAT) und indirekte Methoden (ON-, Off-model, z-score) tragen dazu bei, die bestehende Testbatterie effektiv zu erweitern (2, 18, 24, 27, 33, 34, 35). Die Ergebnisse unserer Studien sollen jedoch demonstrieren, dass nicht nur die Erweiterung von Testparametern und damit die weitere Offenlegung medizinischer Daten nötig ist, sondern gleichermaßen eine Durchsichtigkeit bzw. Dokumentation der Messmethodik erfolgen sollte.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

Der in der vorgestellten Studie ermittelte Referenzbereich für %RET für Kader-Athleten zeigt keine Abweichung von denen in gängiger medizinischer  Literatur  angegeben  Referenzbereichen.  Es  konnte jedoch erneut in drei Teilstudien nachgewiesen werden, dass von methodisch  bedingten,  systematischen  Messvarianzen  für  %RET auszugehen ist. Als Folge ergeben sich drei Konsequenzen:

  • Es  sollte  eine  hohe  Standardisierung  der  Durchführungen von Messungen zur Erfassung intraindividueller Referenzbereiche für Retikulozyten und zur Dopingkontrolle angestrebt werden, bei der nur ein Gerätetyp zur Anwendung kommt.
  • Ist die Anwendung eines Gerätetyps nicht durchführbar, ist es unumgänglich, ermittelte Messwerte nur im Zusammenhang mit  Referenzbereichen,  die  mit  derselben  Methode  erhoben wurden zu interpretieren.
  • Grenzwerte müssen in Abhängigkeit der Messmethode definiert werden, woraus folgt, dass Proben von Athleten nur mit dieser Messmethode kontrolliert werden dürfen.

Angaben zu finanziellen Interessen und Beziehungen, wie Patente, Honorare oder Unterstützung durch Firmen: Keine.

LITERATUR

  1. Ashenden MJ, Variet-Marie E, Lasne F, Audran M: The effects of microdose recombinant human erythropoietin regimens in athletes. Haematologica 91 (2006) 1143-1144.
  2. Ashenden MJ, Gore CJ, Parisotto R, Sharpe K, Hopkins WG, Hahn, AG: Effect of altitude on second-generation blood tests to detect erythropoietin abuse by athletes. Haematologica 88 (2003) 1053-1062.
  3. Ashenden MJ, Lacoste A, Orhant E, Audran M, Sharpe K: Longitudinal variation of hemoglobin and reticulocytes in elite rowers. Haematologica 89 (2004) 1403-1404.
  4. Ashenden MJ, Sharpe K, Damsgaard R, Jarvis L: Standardization of reticulocyte values in an antidoping context. Am J Clin Pathol 121 (2004) 816-825.
  5. Bain BJ, Huhn D: Roche Grundkurs hämatologische Morphologie. Blackwell-Wiss.-Verl., Berlin, Wien, 1997.
  6. Banfi G: Reticulocytes in sports medicine. Sports Med 38 (2008) 187- 211.
  7. Banfi G, Mauri C, Morelli B, Di Gaetano N, Malgeri U, Melegati G: Reticulocyte count, mean reticulocyte volume, immature reticulocyte fraction, and mean sphered cell volume in elite athletes: reference values and comparison with the general population. Clin Chem Lab Med 44 (2006) 616-622.
  8. Banfi G, Tavana R, Freschi M, Lundby C: Reticulocyte profie in toplevel alpine skiers during four consecutive competitive seasons. Eur J Appl Physiol 109 (2010) 561-568.
  9. Berglund B, Ekblom B, Ekblom E, Berglund L, Kallner A, Reinebo P, Lindeberg S: Th swedish blood pass project. Scand J Med Sci Sports 17 (2007) 292-297.
  10. Böning D, Maassen N: Wirkungsmechanismen von Erythro-poetindoping. Dtsch Z Sportmed 59 (2008) 175-177.
  11. Briggs C, Grant D, Machin SJ: Comparison of the automated reticulocyte counts and immature reticulocyte fraction measurements obtained with the ABX Pentra 120 Retic blood analyzer and the Sysmex XE-2100 automated hematology analyzer. Lab Hematol 7 (2007) 75-80.
  12. Bruhn HD, Fölsch UR, Schäfer H: Labormedizin. Schattauer, Stuttgart, 2008.
  13. Buttarello M, Bulian P, Farina G, Petris MG, Temporin V, Toffolo L: Five fully automated methods for performing immature reticulocyte fraction: comparison in diagnosis of bone marrow aplasia. Am J Clin Pathol 117 (2002) 871-879.
  14. Corberand JX: Reticulocyte analysis using flw cytometry. Hematol Cell Thr 38 (1996) 487-494.
  15. Dimopoulou HA, Theodoridis T, Galea V, ChristopoulouCokkinou V, Spyridaki MH, Georgakopoulos CG: ISO/IEC 17025 Sysmex R-500 hematology reticulocyte analyzer validation. Lab Hematol 13 (2007) 43-48.
  16. Dörner K: Klinische Chemie und Hämatologie. Georg Theme Verlag, Stuttgart, 2001.
  17. Elliott S: Erythropoiesis-stimulating agents and other methods to enhance oxygen transport. Br J Pharmacol 154 (2008) 529-541.
  18. Gore CJ, Parisotto R, Ashenden MJ, Stray-Gundersen J, Sharpe K, Hopkins W, Emslie KR, Howe C, Trout GJ, Kazlauskas R, Hahn AG: Second-generation blood tests to detect erythropoietin abuse by athletes. Haematologica 88 (2003) 333-344.
  19. Guder WG, Narayanan S, Wisser H, Zawta B: Diagnostic Samples: From the patient to the laboratory. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2009.
  20. Hallbach J: Klinische Chemie und Hämatologie für den Einstieg. Georg Theme Verlag, Stuttgart, 2006.
  21. Hallmann L: Klinische Chemie und Mikroskopie. Georg Theme Verlag, Stuttgart, New York, 1980.
  22. Kraaijenhagen RJ: Reticulocyte reference values by the Bhattacharya method: results of a pilot study. Clin Lab Haematol 18 Suppl 1 (1996) 15 -16.
  23. Malcovati L, Pascutto C, Cazzola M: Hematologic passport for athletes competing in endurance sports: a feasibility study. Haematologica 88 (2003) 570-581.
  24. Morkeberg J, Belhage B, Ashenden M, Borno A, Sharpe K, Dziegiel MH, Damsgaard R: Screening for autologous blood transfusions. Int J Sports Med 30 (2009) 285-292.
  25. Morkeberg J, Saltin B, Belhage B, Damsgaard R: Blood profies in elite cross-country skiers: a 6-year follow-up. Scand J Med Sci Sports 19 (2009) 198-205.
  26. Morkeberg JS, Belhage B, Damsgaard R: Changes in blood values in elite cyclist. Int J Sports Med 30 (2009) 130-138.
  27. Parisotto R, Ashenden MJ, Gore CJ, Sharpe K, Hopkins W, Hahn AG: The effect of common hematologic abnormalities on the ability of blood models to detect erythropoietin abuse by athletes. Haematologica 88 (2003) 931-940.
  28. Parisotto R, Gore CJ, Hahn AG, Ashenden MJ, Olds TS, Martin DT, Pyne DB, Gawthorn K, Brugnara C: Reticulocyte parameters as potential discriminators of recombinant human erythropoietin abuse in elite athletes. Int J Sports Med 21 (2000) 471-479.
  29. Porstmann B: Retikulozyten. Wachholz, Nürnberg, 1993.
  30. Preloznik-Zupan I, Cernelc P, Zontar D: Reticulocyte analysis using light microscopy and two diffrent flw cytometric procedures. Pflgers Arch 440 (2000) R185-R187.
  31. Robinson N, Schweizer C, Cardis Ch, Saugy M, Kamber M, Schattenberg L, Mangin P: Haematological and biochemical parameters form all professional cyclists during the Tour de Suisse 1999. Schweiz Z Sportmed Sporttraumatol 48 (2000) 104-110.
  32. Schmidt W, Maassen N, Trost F, Böning D: Training induced effcts on blood volume, erythrocyte turnover and haemoglobin oxygen binding properties. Eur J Appl Physiol Occup Physiol 57 (1988) 490-498.
  33. Schmidt W, Prommer N, Steinacker JM, Böning D: Sinn und Unsinn von hämatologischen Grenzwerten im Ausdauersport - Folgerungen aus den Dopingskandalen von Turin 2006. Dtsch Z Sportmed 57 (2006) 54-56.
  34. Schmidt WFJ, Heinicke K: Screening der totalen Hämoglobinmenge bei Triathleten und professionellen Radrennfahrern. Dtsch Z Sportmed 59 (2008) 146-152.
  35. Sharpe K, Ashenden MJ, Schumacher YO: A third generation approach to detect erythropoietin abuse in athletes. Haematologica 91 (2006) 356-363.
  36. Sharpe K, Hopkins W, Emslie KR, Howe C, Trout GJ, Kazlauskas R, Ashenden MJ, Gore CJ, Parisotto R, Hahn AG: Development of reference ranges in elite athletes for markers of altered erythropoiesis. Haematologica 87 (2002) 1248-1257.
  37. Tarallo P, Humbert JC, Fournier B, Mahassen P, Henny J: Reticulocytes: reference limits. Clin Lab Haematol 18 Suppl 1 (1996) 13 -14.
  38. Tarallo P, Humbert JC, Mahassen P, Fournier B, Henny J: Reticulocytes: biological variations and reference limits. Eur J Haematol 53 (1994) 11-15.
  39. Thomas L: Labor und Diagnose. TH-Books-Verl.-Ges., Frankfurt/Main, 2000.
  40. Thomas L: Labor und Diagnose. TH-Books-Verl. Ges., Frankfrut/Main, 2005.
  41. Van den Bossche J, Devreese K, Malfait R, Van d V Wauters A, Neeis H, De Schouwer P: Reference intervals for a complete blood count determined on diffrent automated haematology analysers: Abx Pentra 120 Retic, Coulter Gen-S, Sysmex SE 9500, Abbott Cell Dyn 4000 and Bayer Advia 120. Clin Chem Lab Med 40 (2002) 69-73.
  42. Van Houte AJ, Bartels PC, Schoorl M, Mulder C: Methodologydependent variations in reticulocyte counts using a manual and two diffrent flw cytometric procedures. Eur J Clin Chem Clin Biochem 32 (1994) 859-863.
  43. Whitley E, Ball J: Statistics review 2: samples and populations. Crit Care 6 (2002) 143-148.
  44. Wilber RL: Current trends in altitude training. Sports Med 31 (2001) 249-265.
  45. Wilber RL: Application of altitude/hypoxic training by elite athletes. Med Sci Sports Exerc 39 (2007) 1610-1624.
  46. Wilber RL: Live high+train low: thinking in terms of an optimal hypoxic dose. Int J Sports Physiol Perform 2 (2007) 223-238.
Korrespondenzadresse:
Silvia Achtzehn
Deutsche Sporthochschule Köln
Institut für Trainingswissenschaft und Sportinformatik
Am Sportpark Müngersdorf 6
50933 Köln
E-Mail: achtzehn@dshs-koeln.de
 
zum Seitenanfang