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The German Journal of Sports Medicine is directed to translational science and clinical practice of Sports Medicine and its adjacent fields, which investigate the influence of physical activity, exercise, training and sports, as well as a lack of exercise affecting healthy people and patients of all age-groups. It addresses implications for prevention, diagnosis, therapy, rehabilitation and physical training as well as the entire Sports Medicine and research in sports science, physiology and biomechanics.

The Journal is the leading and most widely read German journal in the field of Sports Medicine. Readers are physicians, physiologists and sports scientists as well as physiotherapists, coaches, sport managers, and athletes. The journal offers to the scientific community online open access to its scientific content and online communication platform.

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Sportmedizin
ÜBERSICHT
BIOANALYTIK & DOPINGPRÄVENTION

Dopingprävention: Methoden, Analytik, Entwicklungstendenzen

Doping Prevention: Methods, Analysis, Trend of Development

ZUSAMMENFASSUNG

Präventive  Dopingforschung  beinhaltet  verschiedene  Aspekte,  zu  denen  unter Anderem  die  Methodenentwicklung  zum  Nachweis  bereits  zugelassener  sowie noch  in  der  Entwicklung  befindliche  Medikamente  gehört.  Zudem  hat  sich  die Notwendigkeit von Testverfahren bezüglich Substanzen, deren klinische Prüfung aufgrund  inakzeptabler  unerwünschter  Wirkungen  nicht  fortgeführt  wurde, mehrfach bestätigt. Beispielhaft sind in der vorliegenden Übersichtsarbeit neue Prozeduren zur Bestimmung von Peptidhormonen (z.B. Gonadorelin), anabolen Wirkstoffen  wie  Methyltrenbolon  und  selektive  Androgenrezeptor  Modulatoren (SARMs),  sowie  des  Peroxisom  Proliferator-aktivierter  Rezeptor  delta  (PPARδ) Agonisten GW1516 dargestellt, welche zur Verbesserung des Antidoping Kampfs entwickelt wurden. Grundlage dieser Methoden ist in allen Fällen die FlüssigkeitsChromatographie / Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), welche höchste Sensitivität und Spezifität bewiesen hat und therapeutische Mengen der gesuchten Verbindungen nachzuweisen ermöglicht. Eine Vielzahl positiver Befunde aufgrund von Methyltrenbolon-Applikationen ist in den letzten Jahren aufgetreten, insbesondere  im  Vorfeld  der  Olympischen  Spiele  in  Peking  2008.  Im  Gegensatz dazu sind die bislang nicht zugelassenen Präparate der SARMs sowie das als Gendoping-Substanz  klassifizierte  GW1516  noch  nicht  im  Rahmen  der  nationalen und internationalen Dopingkontrollen aufgefallen. Die nachweisliche Verfügbarkeit dieser Präparate über legale und illegale Bezugsquellen jedoch erfordert eine umgehende und umfassende Analytik dieser neuen Substanzen, um bereits vor deren Markteinführung einen Missbrauch im Sport einzuschränken.

Schlüsselwörter: Dopinganalytik,  anabole  Wirkstoffe,  SARMs,  Gonadorelin, GW1516.

SUMMARY

Preventive doping research comprises various aspects including, amongst others, development of test methods for approved drugs as well as those currently being investigated. Moreover, the necessity to establish detection assays for those compounds that did not complete clinical trials due to inadequate undesirable effects has been proved several times. In the present report, new procedures allowing the detection  of  peptide  hormones  (e.g.,  gonadorelin),  anabolic  agents  such  as  methyltrenbolone and selective androgen receptor modulators (SARMs) as well as the  peroxisome  proliferator-activated  receptor  delta  (PPARδ)  agonist  GW1516, are  described,  which  have  been  developed  to  improve  the  anti-doping  fight. These methods are all based on liquid chromatography – tandem mass spectrometry  (LC-MS/MS),  which  has  demonstrated  utmost  sensitivity  and  specificity and allowed the determination of therapeutic amounts of the target analytes. A considerable number of adverse analytical findings due to methyltrenbolone applications was reported during the last years, particularly before and during the Olympic Games in Beijing 2008. In contrast, the lead drug candidates of SARMs as well as GW1516 (which is classified as gene doping substance) that are currently undergoing advanced clinical trials have not been detected in national as well as international antidoping controls yet. The proved availability of those compounds via legal as well as illegal routes however necessitates the immediate and comprehensive analysis of these substances to limit the options of misuse in sports before the drugs are officially launched.

Key words: doping analysis, anabolic agents, SARMs, gonadorelin, GW1516.

EINLEITUNG

Dopingkontroll-Laboratorien  sind  kontinuierlich  aufgefordert bestehende  Nachweisverfahren  zu  verbessern,  zu  erweitern,  und neue Testmöglichkeiten für bereits zugelassene oder in klinischen Erprobungsphasen befindliche Medikamente zu erstellen. Zudem sind in der Vergangenheit mehrfach Dopingsubstanzen aufgefunden worden, die entweder bereits in frühen klinischen Testphasen als unzureichend sicher eingestuft und daher nicht weiter verfolgt wurden, oder aber niemals für solche Testphasen vorgesehen waren. Diese im Besonderen stellen große Herausforderungen an Analyseverfahren, die im Allgemeinen eine Zielanalytik darstellen und somit lediglich bereits bekannte Substanzen erfassen.
Eine  grundlegende  Technologie  zum  eindeutigen  Nachweis dopingrelevanter Verbindungen ist die Flüssigkeits-Chromatographie – Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS), mit deren Hilfe sowohl  niedermolekulare  Verbindungen  wie  anabole  Wirkstoffe (z.B.  anabol-androgene  Steroide  und  selektive  Androgenrezeptor Modulatoren (SARMs)) und Peroxisom Proliferator-aktivierter Rezeptor delta (PPARδ) Agonisten (z.B. GW1516) aber auch Peptidhormone wie beispielsweise Gonadorelin empfindlich in Blut- oder Urinproben bestimmt werden können. Anhand dieser Beispiele sollen im Folgenden neuere Methoden und Entwicklungstendenzen in der Dopinganalytik dargestellt werden.
Eine  der  grundlegenden  Herausforderungen  in  diesem  Zusammenhang stellt die Vielzahl und chemische sowie pharmakologische  Variabilität  neuer  Therapeutika  dar.  Ein  Nachweis  aller potentiell missbräuchlich einzusetzenden Substanzen bedarf verschiedener komplementärer Analyseverfahren, von denen sich die LC-MS(/MS)  insbesondere  mit  hochauflösender und akkurater Massenbestimmung als die Umfangreichste herausgestellt hat, die auch  rückblickend  durch  erneute  Evaluation  bereits  aufgenommener  Daten  den  Missbrauch  verbotener  Präparate  ermöglicht. Dennoch werden weitere, speziell auf einzelne Analyten  fokussierte Verfahren nötig sein, um die erforderliche Spezifität und/oder Sensitivität zum Zwecke der Dopinganalytik erlauben.

GONADORELIN

Der  Gebrauch  des  Peptidhormons  Gonadorelin  (auch  luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) genannt) ist laut  Verbotsliste der  Welt  Anti-Doping  Agentur  (WADA)  im  Sport  nicht  zulässig. Wenn auch nicht namentlich erwähnt, fällt Gonadorelin unter die Bestimmung, dass die Releasing-Faktoren der aufgeführten Peptidhormone, zu denen das luteinisierende Hormon (LH) gehört, verboten sind. Gonadorelin ist als pharmazeutisches Präparat erhältlich und dessen Missbrauch im Leistungssport ist durch geständige Athleten  bestätigt  worden.  Ein  Nachweisverfahren  basierend  auf der Isolierung des intakten Decapeptids (Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-GlyLeu-Arg-Pro-Gly-NH2) aus Urin ist 2008 beschrieben worden und erzielt durch die kombinierte Anwendung von  immunchemischer Bindung  an  einen  spezifischen  primären  Antikörper,  gefolgt von  Extraktion  durch  Nanopartikel-gebundene  sekundäre Antikörper  und  anschließende  Messung  mit  Nano-FlüssigkeitsChromatographie  und  hochakkurater/hochauflösender  Tandem Massenspektrometrie  die  erforderliche  Sensitivität  und  Spezifität (12). Patientenurine, die nach Behandlung mit Gonadorelin gesammelt und analysiert wurden, zeigten Konzentrationen zwischen 20 und 100 pg/mL auf, die mit der entwickelten  Bestimmungsmethode (Nachweisgrenze 5 pg/mL) erfasst werden konnten und so die Einsetzbarkeit in der Dopinganalytik belegen.

ANABOLE WIRKSTOFFE – ANABOL-ANDROGENE STEROIDE

Anabol-androgene  Steroide  (AAS)  repräsentieren  seit  Jahrzehnten  eine  der  häufigsten  Ursachen  positiver  Befunde  in  der Dopinganalytik. Um die verbesserten Testverfahren zu unterwandern, hat es in der Vergangenheit Entwicklungen von so genannten  Designer  Steroiden  gegeben,  die  ausschließlich  zu  Dopingzwecken hergestellt wurden. Zudem wurden mehrere AAS, deren unerwünschte Wirkungen eine Zulassung im Human- oder Veterinärbereich  nicht  erlaubten,  auf  illegalen  Wegen  vertrieben  und im  Leistungssport  eingesetzt.  Eines  dieser  Präparate  ist  Methyltrenbolon (Abbildung 1a, auch Methyltrienolon genannt), welches bereits  1963  beschrieben  wurde  und  seitdem  als  R1881  aufgrund seiner  besonderen  Androgenrezeptor-Bindungseigenschaften  als Referenzsubstanz  für  Neuentwicklungen  anabol-androgener  Verbindungen  in  präklinischen  Studien  eingesetzt  wird.  Aufgrund schwerwiegender  hepatotoxischer  Wirkungen  ist  Methyltrenbolon selbst als mögliches Medikament jedoch nicht weiter verfolgt worden.  Dennoch  wurde  diese  Substanz  2008  vor  den  Olympischen  Spielen  in  Peking  unter  anderem  bei  11  Gewichthebern (9) und einer Leichtathletin mit Hilfe von LC-MS/MS festgestellt. Hierbei lieferten charakteristische Produkt-Ionen wie m/z 227, die im  Besonderen  bei  Analyten  mit  struktureller  Verwandtschaft  zu Trenbolon vorgefunden werden, entscheidende Hinweise, und die Anwesenheit des nicht zulässigen Wirkstoffs wurde schließlich im Abgleich mit der Referenzverbindung des Methyltrenbolons bewiesen. Ein typisches Analyseergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt.

ANABOLE WIRKSTOFFE – SELEKTIVE ANDROGENREZEPTOR MODULATOREN (SARMS)

SARMs stellen eine neue Generation anaboler Wirkstoffe dar, die strukturell nicht mit AAS verwandt sind aber die Eigenschaft besitzen, Androgenrezeptoren zu aktivieren oder zu inhibieren. Aufgrund beschriebener Gewebe- und Wirkungs-Selektivität sind diese Substanzen in klinischen Testphasen zur Anwendung bei verschiedenen Krankheitsbildern wie z.B. Kachexie oder Sarkopenie oder aber zur Kontrazeption bei Männern (1, 2, 4). Umfangreiche  anabole Eigenschaften  konnten  erfolgreich  von  androgenen  Wirkungen separiert  werden  und  somit  medizinisch   vielversprechende Alternativen zu AAS bei Steroidersatztherapien entwickelt werden, die  jedoch  ebenfalls  ein  großes  Missbrauchspotential  besitzen. Aufgrund  dessen  sind  SARMs  seit  Januar  2008  durch  die  WADA verboten  worden  und  zahlreiche  Nachweisverfahren  bereits  vor einer Markteinführung präsentiert worden. Die Notwendigkeit dieser präventiven Maßnahmen hat sich 2009 bestätigt als ein erstes Schwarzmarktprodukt mit dem Wirkstoff Andarine (Abbildung 1b, auch S-4 genannt) via Internet bestellt und erhalten wurde. Die Authentizität dieses Präparats wurde mit Hilfe der Massenspektrometrie und synthetisierter Referenzmaterialien bestätigt, so dass eine Verbreitung dieser Substanz im Sport nicht ausgeschlossen werden kann (8). Neben dem gewünschten Wirkstoff wurden Verunreinigungen identifiziert, die auf eine Herstellung unter nicht-pharmazeutischen Qualitätsrichtlinien hindeuten und nicht kalkulierbare gesundheitliche Risiken für den Sportler bedeuten. Basierend auf Studien,  die  den  menschlichen  Metabolismus  von  Andarine  simulieren  (3, 10),  wurde  bereits  seit  2008  bei  Dopingkontrollen  in Deutschland auf die Anwesenheit dieses Produkts getestet, wobei bislang kein Fund der zu verabreichenden Substanz oder deren Metaboliten aufgetreten ist.

GENDOPINGSUBSTANZEN

Die Klasse M3 der WADA Verbotsliste betrifft die Kategorie „Gendoping“ und beinhaltet sowohl den Transfer fremden genetischen Materials als auch die Beeinflussung der Genexpression. Letztere ist im Zusammenhang mit Substanzen wie dem PPARδ Agonisten GW1516  erwähnt  (Abbildung  1c),  welcher  in  Tiermodellen  zu  signifikanten  Leistungssteigerungen  geführt  hat  (5).  Diese  vollsynthetische Verbindung wird bezüglich Ihres Einsatzes zur Behandlung des metabolischen Syndroms und damit zusammenhängende gesundheitliche  Folgekomplikationen  erforscht  und  hat  bereits fortgeschrittene klinische Testphasen durchlaufen. Aufgrund eines möglichen illegalen Einsatzes im Sport sind solche Präparate seit Januar  2009  namentlich  verboten  und  erste  Nachweisverfahren basierend  wiederum  auf  LC-MS/MS  sind  vorgestellt  worden.  Zunächst wurde aufgrund fehlender Informationen zu urinären Metaboliten die Zielsubstanz in Blutproben analysiert (7), da hierzu detaillierte Daten aus pharmakologischen Studien vorlagen, welche die zu erwartende Plasmakonzentrationen des intakten Analyten beschreiben  (6).  Nachfolgend  konnten  zwei  wesentliche  urinäre Stoffwechselprodukte identifiziert werden (11), die als die entsprechenden Sulfoxide und Sulfone des GW1516 beschrieben wurden und  gegenwärtig  die  Zielsubstanzen  in  Routinedopingkontrollen für  diesen  PPARδ Agonisten  darstellen.  Auch  wenn  bislang  kein Hinweis oder Beweis für einen Einsatz solcher Präparate im Sport vorliegt, ist die Wahrscheinlichkeit des Missbrauchs gegeben und die Verfügbarkeit als Chemikalie und eventuell auch als Schwarzmarktprodukt  nicht  ausgeschlossen.  Auch  hier  wird  die  Idee  der Dopingprävention durch frühzeitige Implementierung neuer, noch nicht vollständig zugelassener Medikamente verfolgt, mit dem Ziel einen möglichen unzulässigen Einsatz unmittelbar zu verhindern.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

Die  Erweiterung  und  Ergänzung  dopinganalytischer  Methoden zum Nachweis zugelassener aber auch in Testphasen befindlicher Medikamente  ist  ein  wesentlicher  Bestandteil  der  präventiven Dopingforschung. Einen Schwerpunkt stellt dabei die FlüssigkeitsChromatographie / Tandem Massenspektrometrie dar, welche die Bestimmung  sowohl  höhermolekularer  Peptidhormone  als  auch niedermolekularer neuer Verbindungen mit der notwendigen Sensitivität und Spezifität erlaubt. Beispielhaft sind in der vorliegenden Arbeit repräsentative Verbindungen der Substanz- und Methodenklassen S1 (anabole Wirkstoffe), S2 (Peptidhormone, Wachstumsfaktoren  und  verwandte  Verbindungen)  und  M3  (Gendoping)  sowie deren Nachweismöglichkeiten präsentiert worden, welche die Möglichkeiten  moderner  und  zukünftiger  Analyseverfahren  aufzeigten sollen. Neben diesen so genannten direkten Testmethoden werden vermehrt indirekte Ansätze in Zukunft die Dopinganalytik ergänzen. Diese indirekten Verfahren werden nicht die verbotene Substanz  oder  Dopingmethode  als  solche  identifizieren,  sondern mit  Hilfe  veränderter,  durch  die  eingesetzten  Maßnahmen  manipulierte, Parameter als unnatürlich klassifizieren lassen und somit einen Verstoß gegen die Anti-Dopingrichtlinien aufzeigen.

Danksagung
Die Autoren danken dem Manfred-Donike-Institut für Dopinganalytik für die Unterstützung des vorgestellten Projekts.

Angaben zu finanziellen Interessen und Beziehungen, wie Patente, Honorare oder Unterstützung durch Firmen: Keine.

LITERATUR

  1. Bhasin S, Jasuja R: Selective androgen receptor modulators as function promoting therapies. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 12 (2009) 232-240.
  2. Chen J, Hwang DJ, Bohl CE, Miller DD, Dalton JT: A selective androgen receptor modulator for hormonal male contraception. J Pharmacol Exp Thr 312 (2005) 546-553.
  3. Kuuranne T, Leinonen A, Schänzer W, Kamber M, Kostiainen R, Thevis M: Aryl-propionamide-derived selective androgen receptor modulators: LC-MS/MS characterization of the in vitro synthesized metabolites for doping control purposes. Drug Metab Dispos 36 (2008) 571-581.
  4. Mohler ML, Bohl CE, Jones A, Coss CC, Narayanan R, He Y, Hwang DJ, Dalton JT, Miller DD: Nonsteroidal selective androgen receptor modulators (SARMs): dissociating the anabolic and androgenic activities of the androgen receptor for therapeutic benefi. J Med Chem 52 (2009) 3597-3617.
  5. Narkar VA, Downes M, Yu RT, Embler E, Wang YX, Banayo E, Mihaylova MM, Nelson MC, Zou Y, Juguilon H, Kang H, Shaw RJ, Evans RM: AMPK and PPARdelta agonists are exercise mimetics. Cell 134 (2008) 405-415.
  6. Pelton P: GW-501516 GlaxoSmithKline/Ligand. Curr Opin Investig Drugs 7 (2006) 360-370.
  7. Thevis M, Beuck S, Thomas A, Kortner B, Kohler M, Rodchenkov G, Schänzer W: Doping control analysis of emerging drugs in human plasma - identifiation of GW501516, S-107, JTV-519, and S-40503 Rapid Commun Mass Spectrom 23 (2009) 1139-1146.
  8. Thevis M, Geyer H, Kamber M, Schänzer W: Detection of the arylpropionamide-derived selective androgen receptor modulator (SARM) S-4 (Andarine) in a black-market product. Drug Test Analysis 1 (2009) 387-392.
  9. Thevis M, Guddat S, Schänzer W: Doping control analysis of trenbolone and related compounds using liquid chromatographytandem mass spectrometry. Steroids 74 (2009) 315-321.
  10. Thevis M, Lohmann W, Schrader Y, Kohler M, Bornatsch W, Karst U, Schänzer W: Use of an electrochemically synthesised metabolite of a selective androgen receptor modulator for mass spectrometry-based sports drug testing. Eur J Mass Spectrom 14 (2008) 163-170.
  11. Thevis M, Möller I, Thomas A, Beuck S, Rodchenkov G, Bornatsch W, Geyer H, Schanzer W: Characterization of two major urinary metabolites of the PPARdelta-agonist GW1516 and implementation of the drug in routine doping controls. Anal Bioanal Chem 396 (2009) 2479-2491.
  12. Thomas A, Geyer H, Kamber M, Schänzer W, Thevis M: Mass spectrometric determination of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in human urine for doping control purposes by means of LCESI-MS/MS. J Mass Spectrom 43 (2008) 908-915.
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Mario Thevis
Deutsche Sporthochschule Köln
Zentrum für Präventive Dopingforschung
Institut für Biochemie
Am Sportpark Müngersdorf 6
50933 Köln
E-Mail: thevis@dshs-koeln.de
 
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