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Die Deutsche Zeitschrift für Sportmedizin behandelt die klinische Praxis und deren angrenzende Felder im Sinne translationaler Forschung, die den Einfluss von körperlicher Aktivität, Bewegung, Training und Sport sowie Bewegungsmangel von gesunden Personen und Patienten aller Altersgruppen erforscht. Dies umfasst die Auswirkungen von Prävention, Diagnose, Therapie, Rehabilitation und körperlichem Training sowie das gesamte Feld der Sportmedizin und sportwissenschaftliche, physiologische und biomechanische Forschung.

Die Zeitschrift ist die führende und meistgelesene deutsche Zeitschrift für die gesamte Sportmedizin. Sie richtet sich an alle Ärzte, Physiologen und sportmedizinisch/sportwissenschaftlich interessierte Wissenschaftler aller Disziplinen sowie an Physiotherapeuten, Trainer, Praktiker und Sportler. Die Zeitschrift ermöglicht allen Wissenschaftlern online Open Access zu allen wissenschaftlichen Inhalten und viele Kommunikationsmöglichkeiten.

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Sportmedizin
ÜBERSICHT
DETEKTION MAKROMOLEKULARER SUBSTANZEN

Detektion ausgewählter makromolekularer Substanzen und Manipulationsversuche in der Dopinganalytik

Detection of Selected Macromolecular Substances and Attempts of Manipulation in Doping Control

Deutsche Sporthochschule Köln, Zentrum für Präventive Dopingforschung/Institut für Biochemie

ZUSAMMENFASSUNG

Die Dopingproblematik hat viele Facetten, und eine der Herausforderungen für die Dopinganalytik sind Makromoleküle wie Peptidhormone (z.B. Erythropoietin und hämoglobin-basierte künstliche Sauerstoffträger) oder modifizierte Polysaccharide (z.B. Hydroxyethylstärke). Moderne Nachweismethoden erlauben deren Detektion in Urin- oder Blutproben, sofern der Zielanalyt nicht durch Manipulation zerstört wurde. Etablierte Bestimmungsverfahren erlauben mit Hilfe der Massenspektrometrie, des Western Blottings, sowie der Gelelektrophorese die Detektion verbotener Substanzen, die jedoch, wie kürzlich gezeigt, durch manipulative Zerstörung mittels Proteasen erschwert werden. Neue Techniken erlauben jedoch auch deren Nachweis, wobei synthetische und körperfremde Proteasen in Urinproben als Dopingvergehen geahndet werden.

Schlüsselwörter: Dopinganalytik, Hydroxyethylstärke, Erythropoietin, Protease

SUMMARY

Doping has many facets, and a particular challenge for sports drug testing laboratories are macromolecules (e.g., erythropoietin and haemoglobin-based-oxygen carriers) or modified polysaccharides (e.g., hydroxyethyl starch). Modern doping control methods enable the detection of these analytes in urine or blood samples as long as the compounds are not destroyed by surreptitious manipulation. Techniques such as mass spectrometry, western blotting, and gel electrophoresis allow the determination of prohibited substances, but recently-described manipulative adulteration by means of proteases considerably complicates these assays. New strategies, however, enable the detection of xenobiotic proteases, the mere presence of which is considered a violation of anti-doping rules.

Key words: Doping analysis, hydroxyethyl starch, erythropoietin, proteases

EINLEITUNG

Die moderne Dopinganalytik erlaubt die Bestimmung von etwa 500 verschiedenen Substanzen, von denen ein Großteil unter die Kategorie der niedermolekularen Verbindungen fällt (31). Makromolekulare Peptidhormone und Proteine wie Erythropoietin (EPO) und quervernetzte hämoglobin-basierende künstliche Sauerstoffträger (HBOCs) aber auch Polysaccharide wie Hydroxyethylstärke (HES) sind ebenfalls Gegenstand aktueller Dopingkontrollen. Die Anwendung solcher Substanzen kann mit Hilfe verschiedener Techniken nachgewiesen werden, wenn die jeweilige Verbindung noch in ausreichenden Mengen in entsprechenden Probenmaterialien vorhanden ist. Während EPO und HES in Urinproben zu bestimmen ist muss für einen Nachweis von HBOCs Plasma oder Blut vorhanden sein. Daher sind Dopingkontrollen, die beide Matrices beinhalten, für eine umfangreiche Analytik von großer Bedeutung. Die Prinzipien des Nachweises der hier exemplarisch dargestellten Substanzen sind vielfältig und werden im Folgenden kurz erläutert, um den Einfallsreichtum im Besonderen im Sinne der Probenmanipulation zu verdeutlichen.

ANALYTIK HÄMOGLOBIN-BASIERENDER KÜNSTLICHER SAUERSTOFFTRÄGER (HBOCS)

Künstliche Sauerstoffträger haben für die Notfallmedizin eine besondere Bedeutung, da diese häufig aufkommende Engpässe von Blutkonserven eliminieren können. Aus diesem Grund sind zahlreiche Varianten auf der Basis chemisch modifizierter Hämoglobine hergestellt worden, die ohne Erythrozyt stabil zirkulieren und Sauerstoff reversibel binden können (11). Dadurch kann eine Versorgung des Organismus nach starkem Blutverlust blutgruppenunabhängig gewährleistet werden, da Blutgruppenantigene durch das Fehlen der Erythrozytenmembran nicht vorliegen. Zudem sind Präparate dieser Art bei Raumtemperatur bis zu 12 Monate lagerbar, was mit konventionellen Blutkonserven in der Regel maximal 42 Tage möglich ist. Verschiedene Versionen von HBOCs sind in klinische Testphasen gelangt, jedoch hat bisher nur ein Präparat die Zulassung für die Humanmedizin erhalten: das Rinderhämoglobinbasierende Produkt Hemopure (Biopure Corp.) darf in Südafrika in der Notfallmedizin eingesetzt werden (4). Alle anderen Anwärter, die u.a. aus humanem Hämoglobin gewonnen wurden, haben bislang aufgrund schwerwiedender Komplikationen keine Zulassung erhalten.
Der Einsatz von HBOCs ist von mehreren Sportlern erwähnt worden, jedoch hat es bisher keinen positiven Dopingfall gegeben, möglicherweise begründet durch den wahrscheinlich sehr geringfügigen leistungssteigernden Effekt (2, 22, 23). Dennoch sind Testverfahren notwendig geworden, welche sowohl schnelle Screening- als auch aufwendige Bestätigungsmethoden beinhalten. Ein erster Hinweis auf die Anwendung von HBOCs ist eine intensive Färbung des Blutplasmas, was eine Folgeuntersuchung mit Hilfe verschiedener Ansätze erfordert. Dabei werden Unterschiede in der Größe der Hämoglobinmoleküle im Rahmen so genannter Größenausschluss-Chromatographien als auch in der Primärstruktur des Rinder- und Humanhämoglobins genutzt.
Aufgrund einer 85%igen Sequenzübereinstimmung erlaubt die enzymatische Degradierung von Plasma, welches mit HBOCs angereichert wurde, eine Differenzierung entstandener Peptide mit Hilfe der Massenspektrometrie (1, 8, 9, 10, 27). Aminosäuresequenzinformationen werden erhalten, die eine eindeutige Zuordnung des vorgefundenen Hämoglobins zur Spezies bos taurus oder homo sapiens ermöglicht. Diese Methodik wird nicht durch hämolysiertes Blut kompromittiert, und sollte ein Rinderhämoglobin-spezifisches Peptid in einer humanen Plasmaprobe vorgefunden werden, ist von einem Verstoß gegen die Antidoping Regeln auszugehen.

ANALYTIK POLYSACCHARIDBASIERTER PLASMAVOLUMENEXPANDER

Plasmavolumenexpander wie beispielsweise HES werden seit Jahrzehnten zur Blutverdünnung, Behandlung hypovolämischer Schockzustände und Verbrennungen, sowie zum Gefrierschutz tiefgekühlter Blutproben eingesetzt (5, 6, 19, 20). Aufgrund seiner maskierenden Eigenschaften sind HES und verwandte Verbindungen durch die Welt Anti-Doping Agentur (WADA) verboten (32), und zahlreiche positive Befunde wurden kurz nach der Etablierung zweier Nachweisverfahren im Jahre 2000 aufgedeckt (28). Die Detektionsmethoden basieren auf der Tatsache, dass HES durch die Hydroxyethylierung der Glucose-Einheiten sich von natürlichen Polysacchariden eindeutig unterscheidet, und die Bestimmung hydroxyethylierter Monomere (29) sowie 1,4-verknüpfter Polysaccharide (30) dieser Untereinheiten in Urinproben eine Applikation von HES bedeutet.
Zum schnellen Nachweis werden Urinproben unter sauren Bedingungen hydrolysiert und entstehende Monosaccharide gaschromatographisch/massenspektrometrisch identifiziert, wobei eindeutig hyxroxyethylierte Glucose identifiziert werden kann. Eine aufwendigere Bestätigungsprozedur, die im Falle verdächtiger Proben zum Einsatz kommt, erlaubt zudem die Bestimmung des polymeren Charakters des Analyts, um eindeutig die intravenöse Verabreichung des Plasmavolumenexpanders zu bestätigen. Hier werden nicht-verknüpfte Hydroxylfunktionen der Polysaccharide methyliert, bevor eine salzsaure Hydrolyse Monomere generiert, deren Verbindungsstellen nicht alkyliert vorliegen und so den ehemals polymeren Status verdeutlichen. Im Jahre 2001 wurde mit Hilfe dieser Techniken systematisches Doping im Finnischen SkiLanglauf Team nachgewiesen.

ANALYTIK REKOMBINANTER ERYTHROPOIETINE

Erythropoietine und deren Mimetika werden therapeutisch zur Behandlung anämischer Zustände eingesetzt, haben jedoch im Besonderen durch zahlreiche Geständnisse und positiver Dopingbefunde verschiedener Sportler einen großen öffentlichen Bekanntheitsgrad als „Ausdauerdrogen“ erhalten. Die analytische Herausforderung bei der Bestimmung dieser Substanzen sind die in den meisten Fällen human-identischen Strukturen, die sich nur in geringem Maße in der Glykan-Komposition unterscheiden. Feinste Differenzen zu humanem, endogen produziertem EPO werden mit modernen Methoden basierend auf isoelektrischer Fokussierung und immunchemischer Visualisierung erreicht (15-17), wobei unterschiedliche Migrationsverhalten eine Trennung von rekombinantem und körpereigenem EPO erlauben. Berichte über „instabile“ Urine und den möglichen Abbau urinären Erythropoietins haben gezeigt, dass die Analyse und Auswertung von EPO-Proben große Erfahrung und genaue Kriterien benötigt (3, 18, 24). Die Vielzahl neuer Biosimilars birgt zudem die Gefahr, dass EPO-Varianten verfügbar sind, deren Strukturen dem humanen EPO so ähnlich sind, dass eine Differenzierung extrem erschwert ist. Hier sind komplementäre Methoden auf der Basis der Gel-Elektrophorese und damit erzielter Trennung nach Größe der Erythropoietine vorgeschlagen worden, welche Dopingkontroll-Laboratorien in die Lage versetzen sollen auch diese aufgrund der unterschiedlichen Mobilität zu bestimmen (13).
Während diese Methoden den direkten Nachweis rekombinanten EPOs erlauben, werden zudem komplementär indirekte Parameter bestimmt und Modelle entwickelt (12, 21, 25), welche als ON- bzw. OFF-Modelle bezeichnet werden. Diese basieren im Wesentlichen auf Hämatokrit, Prozentanteil Retikulozyten, Prozentanteil Makrozyten, Serum EPO und löslicher Transferrinrezeptor Konzentrationen (ON-Modell) bzw. Hämatokrit und Prozentanteil Retikulozyten unter Berücksichtigung der Hämoglobinkonzentration (OFF-Modell). Dabei werden sowohl der gegenwärtige Wert als auch der Mittelwert vorangegangener Messungen einbezogen und liefern somit den so genannten z-score (25).

BESTIMMUNG VON MANIPULATION MITTELS PROTEASEN

In Dopinganalysen können nur Verbindungen bestimmt werden, die zum Zeitpunkt der Tests im Urin messbar vorliegen. Obwohl diese Aussage trivial erscheint sind Aussagen und Geständnisse verschiedener Radsportler diesbezüglich von besonderer Bedeutung (7). Der Einsatz von „Reiskörnern“ zur Verschleierung des EPO-Missbrauchs wurde berichtet, wobei alle urinären Parameter wie z.B. Steroidprofile unbeeinflusst bleiben. „Reiskörner“ wurden vor der Dopingkontrolle in die Harnröhre eingeführt, welche dann bei der Urinabgabe in das Kontrollgefäß gelangten. Die Annahme, dass es sich hierbei um Proteasegranulate gehandelt hat wurde durch verschiedene Untersuchungen bestätigt, bei welchen die Protein-zerstörende Eigenschaft der Proteasen zu negativen Testergebnissen innerhalb von 15 min nach Urinabgabe geführt hat (14, 26).
Proteasegranulat und ähnliche Verbindungen sind in handelsüblichen Waschmitteln, Spülmaschinen-Tabs, Kontaktlinsenreinigern, etc. jeder Person zugänglich, und zudem in Form von verschiedenen rezeptfrei erhältlichen Produkten erhältlich. Die Abwesenheit normal endogen produzierter Proteine in Urinproben ist jedoch kein Beweis für eine Manipulation, und eindeutige Bestimmungen verbotener Substanzen ist nach wie vor obligatorisch. Daher wurden mehrstufige Testverfahren etabliert, die sowohl die Proteaseaktivität in Urinen, aber auch die An-/Abwesenheit normal ausgeschiedener Proteine bestimmt. Schließlich wird gel-elektrophoretisch und massenspektrometrisch bestimmt, ob körperfremde Proteasen in Dopingkontroll-Proben vorgelegen haben. Nur wenn der letzte Punkt erfüllt ist, kann eine manipulative Veränderung des urinären Proteoms belegt und ein Dopingvergehen bewiesen werden.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

Die Vielfalt der Dopingmaßnahmen, welche die Applikation von leistungssteigernden Mitteln, Maskierung, aber auch Manipulation von Urinproben beinhaltet stellt stets neue Herausforderungen an die Dopinganalytik. Hier werden modernste analytische Verfahren eingesetzt und weiter entwickelt, um dem Missbrauch von Medikamenten im Sport Grenzen zu setzen. Diese Methoden beinhalten überwiegend massenspektrometrische Verfahren, werden aber notwendigerweise durch immunologische Tests und Vorbereitungsschritte komplementiert.

Angaben zu finanziellen Interessen und Beziehungen, wie Patente, Honorare oder Unterstützung durch Firmen: Keine.

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Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Mario Thevis
Deutsche Sporthochschule Köln
Zentrum für Präventive Dopingforschung
Institut für Biochemie
Am Sportpark Müngersdorf 6
50933 Köln
E-Mail: thevis@dshs-koeln.de
 
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